分子克隆经验交流 071202.

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1 分子克隆经验交流 071202

2 准备好了吗？ 你知道自己所做实验的前前后后吗？ 准备好持久作战了吗？ 有没有整理的习惯？ 敢于大胆讨论？ “没有失败就不会进步”
好奇与肯干并行 有没有整理的习惯？ 自己的资源：文献、笔记、思路及实验系统（PCR体系、连接体系等） 公用的资源： 敢于大胆讨论？

3 交流的范围：让目的基因在E.coli中表达

4 第一部分：目的片段了解有多少

5 目的片段？ 文献：中文期刊网、万方、pubmed、http://scholar.google.com/schhp?hl=zh-CN 等
“关键词” 有所选择的看； 好的文献要在实验中不断的看，反复的看。 专利：中国专利局、patenthunter、

6 对你的片段了解有多少？ 影响因素： 工具： 核酸：GC含量、里面有什么样的酶切位点
蛋白：亲疏水性（膜蛋白很难表达）、大小（5~100KD）、Cys（二硫键） 工具： DNAStar软件包中：EditSeq可以分析GC含量，蛋白大小，Protean可以分析蛋白的亲疏水性。 Oligo可以查找内切酶位点。 在线预测一些信号肽预测等。

7 引物设计（克隆引物） 考虑的因素：长度、Tm值、Loop值、要不要终止密码等； 设计之前一定要分析序列自身的酶切位点；
设计时考虑通用性——酶切位点的选择； 引物合成最好是分两管； 公司合成的引物可能会出错或没有分装！ 有些时候可以将错就错 要不要突变引物 直接扩增获取小片段

8 BamH I与Bgl II同尾酶 BamH I：GGATCC Bgl II ：AGATCT T载体的正插与反插

9 突变引物的设计 主要考虑引物3‘端加T（或A）

10 PCR扩增 要有一个稳定的PCR系统（Buffer、dNTP、Taq等最好分装） 普通大小的片段用rTaq即可，但突变是完全可能的。
循环数不用太多。 扩增时最好加石蜡油。 PCR最怕污染了！！！！ 突变PCR最好测一下序。

11 连接T载及转化 如果有设计保护碱基此步可省； Takara体系效率很高； 转化：
Amp抗性失效问题：菌在平板上长久了会分泌酰胺酶降解Amp，产生卫星菌落。 酶切过程要分析T载上的酶切位点及片段自身酶切位点，分析正反插。 Buffer选择。 双酶切切载体时，最好先用一种酶切完后用另一种。

12 第二部分：做进表达载体

13 表达载体 非融合表达： 融合表达 其他载体（分泌表达、可溶性表达等） 辅助表达：CKS等
辅助构象折叠及二硫键形成：TRX、MBP、GST、NusA等 纯化：Pet、GST等 其他载体（分泌表达、可溶性表达等）

14 整框和非整框； 标签：可多标签； 对现有载体进行改进：

15 表达不出来，怎么了？ 重新分析序列，是否有终止密码（非常用密码子）、设计不整框、引物出错等； 重新完成一遍，耐心的；
调节表达条件：改变温度、IPTG、抗性的量、培养基（Tryphone含有微量乳糖） 更换载体： 更换表达菌株： 换人做做，不行暂时放弃吧！

16 表达菌株

17 谢谢！！