特定DNA 片段甲基化检测方法 周慧敏.

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1 特定DNA 片段甲基化检测方法 周慧敏

2 哺乳动物中，CpG序列在基因组中出现的频率仅有1%，远低于基因组中的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中，CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，形成所谓的CpG岛。
通常，CpG岛大约含有500多个碱基。在哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛，而且只有CpG岛的胞嘧啶能够被甲基化，CpG岛通常位于基因的启动子区或是第一个外显子区。 健康人基因组中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛外的CpG位点则通常是甲基化的。这种甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留。 当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，以致于染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的丢失。

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4 DNA的甲基化修饰，指CpG二核昔酸中胞嘧啶的5 位碳原子加上一个甲基基团，形成5 甲基胞嘧啶。由于甲基基团很小，对其研究具有一定的难度。一般而言，可以分辨出甲基化修饰的方法有以下几种：
b、亚硫酸氢盐的修饰； c、特异性识别甲基化修饰DNA的抗体或蛋白； d、质谱或色谱等精密检测手段。 由于受到仪器等条件的制约，应用比较广泛的是前三种方法。

5 甲基化检测方法分为两类 , 甲基化分型(m ethy la tion typ ing ) 和甲基化图谱( methy lation prof iling), 后者又被称为甲基化组学( methy lome)。 甲基化分型技术通常应用于较少位点的检测, 多为单基因的甲基化检测。 甲基化图谱则是对大范围的基因甚至是全基因组的甲基化分析。

6 一、甲基化分型 绝大多数的DNA 甲基化分型均基于聚合酶链反应( PCR )的方法, 使用亚硫酸氢钠处理过的DNA 作为模板。PCR 引物设计上通常存在2 种策略: 甲基化非依赖性PCR( methy lation􀀁independent PCR, M IP)引物: 甲基化特异性PCR ( m ethylat ion specific PCR, MSP)引物。

7 （1） 甲基化特异性PCR (m ethylat ion2specif ic PCR,M S PCR )　
该法是检测基因组DNA 甲基化水平的一种常用方法, 原理是DNA 经亚硫酸氢钠处理后, 非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶, 而甲基化的胞嘧啶保持不变。 在PCR 反应时, 有两套不同的引物对: 其一引物序列来自经处理后的甲基化DNA 链, 若用该对引物能扩增出片段, 说明该检测位点发生了甲基化; 另一引物来自经处理后的非甲基化DNA 链, 若用该对引物能扩增出片段, 说明该检测位点没有甲基化。 两对引物都具有很高的特异性, 与未经处理的DNA 序列无互补配对。

8 M S PCR 是一种快速检测方法, 只需极少量的DNA 用于分析。
不足之处在于: ①引物的选择和设计非常关键, 否则易导致假阳性; ②如果亚硫酸氢钠对DNA 处理不完全, 也易导致假阳性; ③M SP 法是以引物中所有CpG 位点胞嘧啶均甲基化为前提设计的, 而事实上甲基化的CpG 岛中却并非每个CpG 位点都完全甲基化, 所以,M SP 法常常存在目标片段难扩增, 或者特异性差等问题, 不能反映整个CpG 岛甲基化状态的缺陷。

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11 中国科学院化学研究所与清华大学的研究人员合作, 发展了基于水溶性阳离子型共轭聚合物的新DNA 甲基化分析方法
中国科学院化学研究所与清华大学的研究人员合作, 发展了基于水溶性阳离子型共轭聚合物的新DNA 甲基化分析方法. 通过荧光共振能量转移技术(FRET)研究了质粒和人肿瘤细胞p16 基因启动子区特异CpG 位点的甲基化状态(原理见图1). 该技术具有较高的灵敏度和特异性,引物无需荧光标记, 检测在均相溶液中进行, 无需分离、纯化手段, 而且与高通量分析兼容, 在癌症临床诊断上具有潜在的应用价值。 共轭聚合物具有强的光捕获能力, 具有倍增光学响应性, 可用来放大荧光传感信号, 为生物传感器的发展提供了新的传感模式.

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13 甲基化非依赖性PCR( methy lation􀀁independent PCR, M IP)引物:
结合亚硫酸盐的限制性内切酶分析: 使用限制性酶消化PCR 产物后区分甲基化和未甲基化的DNA。用亚硫酸盐修饰后, 甲基化和未甲基化的DNA 测序的差异可以导致新的甲基化依赖的限制性位点的产生, X iong等发展的联合亚硫酸盐限制性分析，通过将琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳产物消化后杂交分析, 可定量检测甲基化位点。 缺点是：只能获得特殊酶切位点甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品DNA中甲基化存在的可能；由于酶和PCR 的使用，序列分析受到限制。

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15 （二）甲基化图谱 高效液相层析及相关方法      高效液相层析(high performance liquid chromatography, HPLC)能够定量测定基因组整体甲基化水平，其过程是：先将DNA 样品经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，将结果与标准品比较，紫外光测定吸收峰值，计算5mC/(5mC+5C)的积分面积得出基因组整体的甲基化水平。Fraga等运用高效毛细管电泳法(high performance capillary electrophoresis, HPCE)处理DNA水解产物确定5mC 的水平，相比HPLC，HPCE 更简便、快速、经济。HPLC 及HPCE 测定基因组整体DNA 甲基化水平的敏感性均较高。