第 四 节 DNA限制酶切反应和 限制酶谱绘制.

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1 第 四 节 DNA限制酶切反应和 限制酶谱绘制

2 一．DNA的限制酶反应 2. 酶切反应类型 3. 酶切反应最适条件
1. 酶单位定义: 使1μg某种DNA在最适反应条件下和1小时内完全酶切所需的限制酶活性。 2. 酶切反应类型 1) 完全酶切 SV40(5243bp) pBR322(4363bp) 2) 部分酶切 3. 酶切反应最适条件 1) DNA分子的组成 i. 碱基组成与排列方式 ii. 识别位点两侧的碱基组成与排列方式，同一DNA分子中不同识别位点的酶切速度可相差10倍（如λ中的EcoRI位点） 2) 反应条件            i. DNA溶液的纯度和浓度（反应浓度） HpaI(C CGG) 依实验目的而定 ThaI (CG CG)

3 ii. 限制酶的纯度和稳定性 i) 纯度：尽可能保持厂家推荐的反应条件 ii) 稳定性：保存和反应 iii. 反应缓冲液：常用三种核心缓冲液，即高（H），中（M），低（L）盐缓冲液，不同温度下的pH值 iv. 反应温度：大多数为37℃ v. 双酶切和多酶切反应 同时酶切和分别酶切。前者要求两种酶使用的缓冲液和反应温度必须相同，即使相同时，一旦发生部分酶切反应，便无法判断是何种酶造成的，因此最好采用后者--分别酶切。 i) 第一种酶切 电泳检查 酚/氯仿纯化 第二种酶切。 可不考虑酶切先后顺序，但操作步骤多。 ii) 采用低浓度盐缓冲液的限制酶切 电泳检查 采用高浓度盐缓冲液的限制酶切。操作简单，但要分先后。 假如两酶切位点相距很近（如多克隆位点区），首先考虑的则是相互间的酶切是否有影响，两种酶切顺序不同时，其结果大不相同。 如SmaI-BamH(c), BamHI-SmaI(p)

4 二、限制酶图谱的绘制 1. 完全酶切作图法 1）单酶切作图法
一长度为5Kb的线状DNA分子用两种限制酶完全酶切的凝胶电泳结果和各位点的可能性排列。要确定其位置，可采用下述辅助方法之一。 i. 单酶部分酶切：部分酶切时，各种可能性均存在，但只有相邻的两个DNA片段才有可能出现在凝胶上。

5 2) 双酶切作图法 ii. 末端标记完全酶切 DNA片段 末端标记 完全酶切 凝胶电泳 EtBr染 色观察 放射自显影
色观察 放射自显影 2) 双酶切作图法 单酶切结果只能确定一种酶的位点，要将两种单酶切结果画在一张图上时则不行

6 分别作图时，同一种酶的两种作图法都是对的，但当作在一张图上时，上述两种可能性中只有一种是对的，因此必须进行双酶切反应，其结果见图
根据上述的原理和步骤，前述的5 Kb片段酶I与酶II的定位结果可用两种方法之一： i) 单酶切 分离DNA片段 第二种酶切 凝胶电泳 ii)单酶切 第二种酶切 凝胶电泳 *如果要同时将两种限制酶定位在一条DNA上时，单酶完全酶切作图就没必要了。

7 2. 末端标记-部分酶切作图法（Smith-Brinstiel法）
DNA片段 末端标记 酶1切 分离带标记 DNA片段 酶2部分酶切 电泳 EtBr染色照相 放射自显影 结果 单端标记方法: 人工合成单端标记法 限制酶切单端标记法

8 单端标记方法1 人工合成单端标记法

9 单端标记方法2 限制酶切单端标记法

10 3. 末端标记双相作图法 方法2仍存在两个不足之处：①酶1的选择不能靠近DNA中央；②需先分离DNA片段，该法可克服上述缺点。 现假设有一片段长10 Kb，其中RE1有三个切点，RE2有一个切点，其图谱可能是:

11 4. Bal31顺序酶解作图法 5. 切口移位作图法(可检测出100bp片段) DNA片段 Bal31处理不同时间取样终止反应 限制酶切
凝胶电泳 染色观察结果 5. 切口移位作图法(可检测出100bp片段) 双链DNA 切口移位 限制酶切 电泳 放射自显影

12 6. 大尺度限制酶作图 1) 条件 i. 电泳方法---脉冲场凝胶电泳 ii. 样品制备---原位DNA制备和酶解
iii.  人工染色体构建---pYAC载体构建 iv.  脊椎动物基因组中的CpG和植物基因组中的CpXpG序列存在 2) 一般作图程序 原位DNA样品制备 原位DNA限制酶切 脉冲场凝胶电泳 染色 观察 3) 大尺度作图用酶 i.  稀有识别序列内切酶----I型内含子内切酶 (真菌细胞核和线粒体基因组,T4噬菌体,衣藻叶绿体和线粒体)；酵母HO内切酶；大肠杆菌recA 虽然这些内切酶识别的序列都很长：10-19 bp，但高等动植物基因组中含有这类位点却极少，因而很少使用

13 可用于大尺度限制酶作图的限制酶具有如下特征：识别8或6 bp序列；富含或只含GC序列；含有CpG序列
ii. II型限制酶 人基因组有45,000个CpG岛,一个长度约为1.5 kb富含GC的DNA片段,其中只有25%的CpG岛未被甲基化,这些CpG岛常位于基因的5’-端,未被甲基化的CpG岛平均长约270 kb 可用于大尺度限制酶作图的限制酶具有如下特征：识别8或6 bp序列；富含或只含GC序列；含有CpG序列 i)  AscI-GGCGCGCC和NotI-GCGGCCGC ii)   FseI-GGCCGGCC和SrFI-GCCCGGGC iii)   SfiI-GGCCNNNNNGGCC iv)   CpoI/CspI/RsrII-CGGA(T)CCG v)   BssHI-GCGCGC,EagI-CGGCCG和SacII-CCGCGG vi)  NaeI-GCCGGC,NarI-GGCGGC,SmaI-CCCGGG vii)  MluI-ACGCGT, NruI-TCGCGA, PvuI-CGATCG, SplI-CGTACG CH3

14 三. 限制酶图谱的用途 2. 突变体检测 1. 基因工程中的应用 1) 克隆载体图谱,便于DNA重组;
三.  限制酶图谱的用途 1. 基因工程中的应用 1)  克隆载体图谱,便于DNA重组; 2)  克隆片段图谱可用于次克隆,体外突变,基因定位,核酸定序. 2. 突变体检测 遗传学图谱必须依赖各种突变体存在,因此必然发生了基因型和表型的变化. 限制酶图谱不必依赖表型变化,酶谱的变化一定是基因型发生了变化,但不一定发生了表型变化,即表型的变化不一定会导致酶谱变化. 1)  缺失突变体的检测:某DNA片段消失,代之以一较小DNA片段. 2)  插入突变体的检测:某DNA片段消失,代之以一较大DNA片段.

15 缺失和插入突变体的检测（I） I II 点突变的检测（II）

16 3）点突变的检测: 某DNA片段消失,代之以两较小的DNA片段
3）点突变的检测: 某DNA片段消失,代之以两较小的DNA片段.前者的长度等于后两者长度之和(位点增加)；某两DNA片段消失,代之以一较大DNA片段，前者的长度之和等于后者长度(位点消失). 3.  重组频率的测定 同一染色体座位上的等位基因可能具有不同的表型,从而构成遗传多型性.等位基因的限制酶谱也可能具有多型性,这就是限制酶片段长度多型性(Restriction fragment length polymorphism, RFLP) 不同个体 总DNA 限制酶完全酶切 Southern印迹 杂交 结果分析

17 当不同个体交配时,除自由组合外,也可发生重组,如不同果蝇交配时,其后代的表型和限制酶谱可为: 表型 红:白=1:1, 限制酶谱 30%个体已发生了重组.
4.   遗传疾病的诊断 分析正常人与遗传病患者的某些DNA片段的限制酶谱,便可发现其差异,并总结出各种遗传疾病的限制酶长度多态性图。临床诊断时，将遗传病可疑患者的限制酶谱与之比较,便可判断其是否患有此病.

18 第五节 DNA 的 连 接

19 一. DNA的连接方法 1. 直接连结法---该法适用于:
两种不同的DNA分子可以经过下述的方法之一进行连接,而方法的选用则是根据其两者末端的DNA结构. 1. 直接连结法---该法适用于: 1)  同种限制酶作用不同DNA片段产生的相同粘性末端 重组DNA可用同种酶再切开,但识别简并序列的限制酶除外(如AraI) 2) 不同种限制酶作用不同DNA片段产生的相容性末端 i.重组DNA分子不能再为这两种酶所作用,如:BamHI/BglII ii.重组DNA分子可为其中一种酶所作用,但为另一种酶作用的可能性较小,如MboI/BamHI 3) PCR产物与特定载体的连接 4) 限制酶和其他方式产生的平整末端.

20 2.人工接头连接法 1) 人工接头（linker）的结构 2) 用途 i. 中轴对称互补,可自行退火形成双链.如:
5'-CCGGAATTCCGG- 3' 3'-GGCCTTAAGGCC-5' ii. 至少有一特定的限制酶识别位点 iii. 某种限制酶的一套人工接头可使插入片段与表达载体保持同相.如: 八聚体 d(GGAATTCC) 十聚体 d(CGGAATTCCG) 十二聚体 d(CCGGAATTCCGG) 2) 用途     i. 平整末端的连接(各种结构的DNA末端均可经过修饰变成平整末端) 退火 2 X 5'-CCGGAATTCCGG-3'

21 3) 连接方法 4) 适用范围 ii. 产生新的克隆位点 iii. 合成匹配接头 人工接头磷酸化 退火形成双链 与目的DNA相连 限制
人工接头连接法适合于那些只有一种DNA片段需加人工接头就可以与另一DNA分子相连的DNA分子.利用人工接头也可使任意两个平端的DNA分子相连.这种直接相连的办法简便,快速,但最后连接起来的DNA可能具有不同的结构.为避免这些结构的产生,可先使一种DNA先加上人工接头后,再与另一种DNA分子相连.

22 3. 匹配接头连接法 人工接头虽然可连接两个具不同末端的DNA分子,但这些末端在加入人工接头前必须变为平整末端.然而,有时实验不容许使用人工接头或使用人工接头不方便,此时,便可使用匹配接头,它可用于直接连接各种具不同末端的DNA分子: i. 平端 + 突起末端(5’-突起, 3’-突起) ii.粘性末端 (5’-突起 + 5’-突起: EcoRI+HindIII 5’-突起 + 3’-突起: EcoRI+PstI 3’-突起 + 3’-突起: PstI+SacI) 1)  匹配接头的结构特点 i.   由两个低聚核苷酸组成 ii. 部分区域可以互补     iii. 退火后的双链低聚核苷酸可以形成两个不同的末端 2)  匹配接头的种类

23 4. 同聚物加尾连接法 5. 连接方法的选择 i. 预制匹配接头(连接平端和粘性末端) 人工接头 + 匹配接头 预制匹配接头
人工接头 + 匹配接头 预制匹配接头 ii. 转换匹配接头(连接5’-突起和3’-突起末端) 二匹配接头退火 转换匹配接头 二人工接头 连接酶 双酶切 转换匹配接头 iii. 单链匹配接头(连接5’-突起和3’-突起末端) 4. 同聚物加尾连接法 在两个不同的DNA分子末端各加上一个可互补的同聚物,即AT或GC. 5. 连接方法的选择 方法选择的依据: 1) 两DNA分子的末端结构 2) DNA 分子的限制酶谱 3) 是否需要回收DNA片段

24 连接方式的选择 结构 结构 载体 加尾 外切酶 载体末端 外源DNA末端 常规连接 脱磷酸化 同聚物 平端连接 补齐,人工接头
结构 结构 载体 加尾 外切酶 5’-突起 相容5’-突起 第二选择 第一选择 不能 不能 不能 5’-突起 非相容5’-突起 不能 结合使用接头 不能 不能 第一选择 3’-突起 相容3’-突起 唯一选择 不能 不能 不能 不能 3’-突起 非相容3’-突起 不能 不能 第一选择 不能 第二选择 或平端 3’-突起 5’-端突起 不能 不能 第一选择 不能 第二选择 (补齐后) 平端 平端 不能 可能 可能 第一选择 可能 平端 ’-或5’-突起 不能 不能 第一选择 不能 第二选择

25 二. DNA的连接反应 1. 连接反应理论 当两种DNA分子相连时,它们可能产生不同的结果,这些结果与以下因素有关:
1.   连接反应理论 当两种DNA分子相连时,它们可能产生不同的结果,这些结果与以下因素有关: 1) 连接反应系统中的总DNA浓度i 2) 一个DNA分子靠近同一分子另一端的有效浓度j, 该值与DNA的长度成反比,即DNA分子越大,该分子的两末端越不易相互作用(即自身环化) 3) 两种不同DNA分子的克分子浓度之比值. 2. 连接反应条件 1) 评估连接反应结果的方法 i.   琼脂糖凝胶电泳 ii.大肠杆菌转化 2) 反应条件

26 i.   温度 ii. ATP浓度      iii. 时间 iv. 连接酶浓度        v.克分子比率

27 第六节          PCR 技 术

28 一．DNA 体外扩增技术 1. PCR反应体系 1) 基本原理(PCR—Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应)
一个DNA经n次扩增后, 一个DNA分子可变为2n个分子DNA扩增需要对待扩增的DNA序列有所了解，至少要对其两侧的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物 2) 基本操作 待扩增的DNA片段+dNTP+Tris·HCl缓冲液+两引物 90℃变性30″ ℃退火30″ 加入Taq DNA聚合酶 75℃ 1′ 进入第二次循环 次循环

29 PCR原理示意图

30 2. PCR产物的鉴定 2) 寡聚核苷酸限制性内切酶片段分析（OR分析，Oligomer Restriction analysis）
OR分析对于PCR产物的限制酶位点上发生了点突变的检测极其有用

31 PCR产物的OR鉴定

32 3) 分子杂交 适合于检测PCR产物的非限制酶位点上碱基突变。它是利用两条引物链间的特异性DNA片段作探针(常为人工合成的一段低聚核苷酸，约20 n.t.).当这种探针的核苷酸序列与待测的DNA核苷酸序列完全互补时才能杂交。如果利用多种等位基因特异性寡核苷酸探针（allele-specific Oligonucleotide, ASO）与PCR产物进行杂交，可检测出PCR产物的碱基突变。 可直接利用斑点杂交方法用于基因型分析

33 4) 核苷酸序列分析             DNA扩增产物 变性 与末端标记的扩增引物或定序引物退火 双脱氧核苷酸链终止反应，测定DNA序列

34 二．Taq DNA聚合酶的特点 2. 最适反应温度为80℃ 3. 最适pH8.0和最佳反缓冲液Tris·HCl
Taq DNA聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌YT-1中分离纯化而得。该酶的分子量为63-68 kD 1. 无磷酸单酯酶、磷酸二酯酶以及单链外切酶活性，无内切酶活性，但具有依赖于聚合酶活性的5’ 3’外切酶活性 2. 最适反应温度为80℃ 3. 最适pH8.0和最佳反缓冲液Tris·HCl 4. 最佳二价阳离子Mg2+ （10 mM） 5. 具良好的热稳定性：在90℃下连续反应30分钟仍有70%的酶活

35 Taq DNA聚合酶的特性

36 当采用Taq DNA聚合酶进行DNA体外扩增时，必须考虑到以下五个参数：
1）热稳定性：在PCR循环中DNA的变性时间常为30-60″，若循环30次，其累计加热变性时间为15-30′。Taq DNA聚合酶在90℃下保温30′仍具有70%酶活性，可大大减少操作步骤，易于实现自动化 *2）模板与引物的特异性：当退火温度和DNA链延伸时温度偏低时，引物与模板配对的特异性大大降低，从而导致一些不需要的DNA片段被扩增。显然，其产物的专一性大大降低，使结果无法分析。由于Taq DNA聚合酶最适反应温度为80℃，退火温度可提高到55℃以上，由此大大减少了引物与模板的非专一性结合，使产物均一性大大增加 **3）合成产率：反应底物和产物在DNA扩增中不断发生变化，最终将会导致聚合反应进入平台期，平台期出现的时间与聚合酶的特性有关。研究表明，利用Klenow片段进行20次扩增后进入平台期，累积产物拷贝数为2×105，当采用Taq DNA聚合酶时，扩增25次后才进入平台期，拷贝数可大4×106 ***4）延伸长度：有时为了获取较长DNA片段的扩增，这就要求DNA聚合酶具有较强的延伸能力。当扩增片段大于250 bp时，Klenow片段和T4聚合酶扩增产率大大降低。利用T7 DNA聚合酶，可使扩增片段达2 Kb。当利用Taq DNA聚合酶时，最长延伸长度为4.4 Kb.

37 经改造的Taq DNA聚合酶可扩增出40 kb的DNA 片段.
5）扩增产物的可靠性：评估DNA聚合酶的一个重要指标是它复制DNA的可靠性，即掺入错误碱基的频率。这对于PCR技术的可靠性是至关重要的。Klenow片段的错误掺入率为10-4，Taq DNA聚合酶的错误掺入率为5×10-3 ，而T4聚合酶的错误掺入率为10-7。 *注：1）退火温度常与引物的长度和碱基组成有直接相关关系，引物越长或GC含量较高，退火的温度可以高些，反之则低些。退火温度越高，引物与模板（即扩增的DNA）结合的特异性越高，这可大大减少非特异性DNA片段的扩增。 引物的长度常为20-28聚体，其中有50%以上的GC含量，无自身互补序列，特别是3'末端不应有内部二级结构，引物加量为每100μl l20pmol. **2)出现平台期的原因可能有：①后期循环酶浓度或聚合时间不足；②引物耗尽；③dNTP耗尽；④产物浓度过高，以致ds-DNA解链后又迅速退火，不能与引物结合。 ***3）链延伸长度与延伸时间有关，对于Taq DNA聚合酶，每分钟可形成2000 n.t.或更多。如果要扩增3-4 Kb的DNA，在72℃下需将酶延伸时间增至3-4分钟。

38 三．PCR方法 1. 强化PCR（Boosted PCR） 将PCR分为两个阶段： 1）引物与模板之比为107，扩增20个周期 2）引物与模板之比为1012 –1013，再扩增10个周期 该法适合于待扩增DNA浓度较低时。 2.混合寡核苷酸引物PCR（mixed oligonucleotide primed amplification of cDNA,MOPAC） 根据各氨基酸最常用的密码子合成一系列引物，对某一特定cDNA进行扩增。 3. 锚定PCR(Anchored PCR，A-PCR)

39 4. 连结PCR(ligation mediated PCR)
该法可用于核苷酸序列测定,DNA足迹分析技术和测定甲基化作用

40 5. 不对称PCR(Asymmetrical PCR)
采用不同引物浓度比率，如50：1，100：1，可得大量拷贝的ssDNA用于测序 6. GC串PCR (GC clamp PCR) 应用变性剂梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)可检测出DNA片段中一对碱基的变化，在DNA分子一端加上一GC串（约40 n.t.）利用它的高解链温度特性，在梯度变性胶上可检测出原DNA链中最高解链区内的点突变

41 7.竞争引物PCR (competitive oligonucieotide primer PCR,COP-PCR)
有一个碱基变化的两种引物在较宽松的复性条件下竞争DNA模板，其中只有完全互补的引物才能大量配对。该法可用于测定某一DNA片段上是否带有某一已知碱基置换。

42 8.等位基因专一PCR(Allele specific PCR,ASPCR)
该法可用于检测点突变。如用于检测镰刀形贫血症。 9.反转PCR(inverserar inverted PCR) 该法可用于扩增已知 序列两侧的未知序列

43 10.反向PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)
主要用于mRNA的PCR扩增

44 12.错配PCR（mismatched PCR)
11.加端PCR(Add-on PCR) 在合成引物时加上研究者所需要的核苷酸序列，如某种限制酶的识别序列，某一基因的调控或其它必需序列 12.错配PCR（mismatched PCR) 利用该法可在一已知DNA序列中引起点突变，缺失突变和插入突变。

45 13.重组PCR(Recombinant PCR)
利用该法可将不同基因的DNA片段连接在一起。

46 四. 定量PCR技术 14. 基因克隆PCR 2. 测定方法 利用该法可获一完整的cDNA克隆。 1. 基本原理 N=N0(1+eff)n
1. 基本原理 N=N0(1+eff)n N-最终拷贝数；N0-起始拷贝数；eff-扩增效率；n-扩增次数 2. 测定方法 竞争PCR法(加入已知量的标准物)；RT-PCR-转录法

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48 五．PCR技术的应用 1. 遗传疾病的诊断 人类镰刀型贫血症是因第六个密码子的第二个字母发生了A→T的改变，从而导致该位点的谷氨酸为缬氨酸所取代。A→T突变还导致限制酶OxaNI位点的消失。 利用PCR技术和限制酶谱分析诊断此分子疾病大致过程如下： DNA扩增 PAGE 染色 观察 比较不同个体的结果 限制酶切 PAGE 染色 观察 此法可在3-4 h获得结果，比常规的Southern杂交法简便、快速。

49 2.传染病的诊断 如果已知某种病原菌(体)中的特异性DNA片段的核苷酸序列，这个片段就可以用于DNA扩增，并利用DNA杂交或凝胶电泳的方法诊断病原体的存在与否。 例如AIDS的诊断，常规方法是利用血清背景和病毒培养，往往需要3-4个星期，采用PCR技术则只需一天左右，且准确率高 3.基因的快速克隆 根据已知基因序列设计PCR引物,可直接在不同的样品中进行PCR扩增,而不必分离纯化生物样品 4. 基因突变 1）缺失突变 2）插入突变 3）点突变----单点和多点突变

50 六. 等温3SR(self-substained sequence replication)反应系统
七. 等温链取代扩增反应系统(SDA, strand displacement amplification)

51 (self-substained sequence replication)
等温3SR反应系统

52 (SDA, strand displacement amplification)
等温链取代扩增反应系统

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