16S-rDNASeq: one-stop pipeline for microbial community diversity analysis based on 16S-rDNAseq 何 飞.

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1 16S-rDNASeq: one-stop pipeline for microbial community diversity analysis based on 16S-rDNAseq
何 飞

2 基本问题 问题1： 针对一个或者多个细古菌菌落，鉴定其成员和定量其成员的丰度 问题2： 针对多个细古菌菌落， 检验是否有差别和分析其差别

3 实验方法 方法1： 细古菌落鸟抢法测序， 数据来源小部分已知或者大部分未知的细古菌全基因组片断，分析复杂和困难
方法2：16S rDNA测序， 数据来自大部分已知细古菌的16S rDNA片断， 分析简易

4 16S rRNA 16s rRNA基因是进化遗传研究的重要对象， 相对于细菌的表型鉴定， 16s rRNA基因检测技术已成为细菌检测和鉴定的使用广泛和快速的工具 16S rRNA基因是存在于原核生物基因组上编码rRNA相对应的DNA序列。 16S rRNA基因长度是1.5kb， 具有高度保守性区域和高度特异性区域，特异性区域成为物种特异的标志序列。

5 实验步骤 细古菌基因组DNA提取 16S rRNA特定区域扩增引物设计 PCR扩增 PCR产物纯化 Roche454测序

6 数据产生 Roche454测序仪产生.sff数据文件 从.sff数据文件提取.fna数据文件和.qual数据文件
.fna数据文件保存碱基序列 >HKSD5CR01D6P3I length=70 xy=1599_2828 region=1 run=R_2012_03_15_01_23_26_GGAGTAGCATGCGTGACGAATCGTAGTTCCGACCATAACGATGCCGACCTTTGACCACGA .qual数据文件保存质量分数序列 >HKSD5CR01D6P3I length=70 xy=1599_2828 region=1 run=R_2012_03_15_01_23_26_ 测序长度分布统计

7 长度分布统计

8 收录16S rRNA序列的常用数据库 NCBI Nucleotide database（NT库） 网址： ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/ GreenGenes database 网址： Ribosomal database project database 网址： Silva: comprehansive ribosomal RNA database 网址：

9 16S rRNA数据分析常用软件 Mothur 网址：http://www.mothur.org/
QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology） 网址： GreenGenes database 网址： Ribosomal database project database 网址：

10 数据分析内容 序列预处理 序列聚类操作分类单元（OTU） Alpha多样性分析 赋予物种分类单元 Beta多样性分析 组间物种分类单元筛选

11 序列预处理 识别和去除序列起始8个碱基样本标记Barcode （perl script）
去出引物序列 下载地址： 执行命令：./seqclean *.fna -v primer.fa 和 ./cln2qual *.fna.cln *.qual 去除序列中的低质量区域 下载地址： 执行命令：/lucy *.fna.clean *.qual.clean -e w –b

12 序列聚类操作分类单元（OTU） 操作分类单元（OTU）: 多条序列相似性为0.97被认为可能属于同一个属（genus）， 相似性为0.99被认为可能属于同一个种（species） 软件下载地址： 执行命令：./uclust --sort *.fa --output *.sort.fa 执行命令：./uclust -input *.sort.fa -uc *.uc

13 Alpha多样性分析 Alpha多样性指标：丰富度（richness）、香农指数（Shannon index）
软件下载地址： 执行命令： ./mothur “collect.single(list=*.txt, freq=10);”

14 丰富度指数稀疏分析图

15 香农指数稀疏分析图

16 赋予物种分类单元 物种分类单元分为6层， 它们依次为domain、phylum、class、order、family、genus
软件下载地址： 执行命令： java –jar rdp_classifier-2.4.jar -q *.fa -o *.output 画物种分类单元丰度比例图， genus的域值设置为0.8

17 物种分类单元丰度比例图

18 Beta多样性分析 取uclust聚类生成的代表性序列进行多序列比对， 多序列比对需要参考核心16S rDNA多序列队列文件：core_set_aligned.fasta.imputed 下载地址： 多序列队列文件： 执行命令：./pynast -p 0 -l 0 -i *.fa -t core_set_aligned.fasta.imputed 构建代表性序列为节点的进化树 下载地址： 执行命令./FastTree –gtr -nt *.tree Beta多样性分析： 样本距离计算 ， 需要序列丰度信息 网站访问地址：

19 样本距离矩阵

20 样本聚类和PCA

21 组间物种分类单元筛选 物种分类单元特征包括5层， 分别是phylum、class、order、family、genus。根据RDP分类器的样本和物种分类单元丰度矩阵结果， 利用统计检验筛选组间的差异物种分类单元特征 ， 如果每个样本组只有一个样本， 采用Fisher精确检验， 如果每个样本组大于等于两 个样本， 采用T检验。 软件下载地址

22 谢 谢！