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Published byΚύρα Κόρακας Modified 5年之前
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目的与要求: 掌握Lowry氏法测定蛋白质含量的原理及方法; 掌握分光光度法
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实验原理: 在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯合,形成蛋白质-铜复合物。(双缩脲反应 Biuret Reaction)
蛋白质分子中带有酚基的酪氨酸极易使酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸还原,生成钼蓝-钨蓝蓝色化合物,蓝色深浅与蛋白质含量成正比。利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制标准曲线,测定样品中蛋白质含量。(还原反应)
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操作步骤 1.取三支试管分两组,按下表操作 试管编号 0 1 2 牛血清白蛋白标准 -- 1.0 -- 蒸馏水(mL) 1.0 -- --
试管编号 牛血清白蛋白标准 蒸馏水(mL) 待测蛋白质溶液(mL)
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2. 各管加入试剂甲5ml混匀放置10分钟。 3.各管加入试剂乙0.5ml后立即混匀,37℃ 水浴30分钟后用500nm单色光比色测定。 4.计算 样品蛋白质含量(ug/ml)
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根据测定管光密度值计算血清蛋白质含量,C测=A测*C标/C测
结果与计算: 根据测定管光密度值计算血清蛋白质含量,C测=A测*C标/C测
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注意事项: 各管加酚试剂时必须快速,并立即摇匀,不应出现混浊。 移液管使用前要看清楚刻度和是否写着快、吹,如有则需要用洗耳球吹出剩余液体 进行测定时,加F olin—酚试剂时要特别小心,因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定,但上述还原反应只在pH=10的情况下发生,故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前,还原反应即能发生。 分光光度计使用前需预热,绝对调零和空白管调节透光度为100%。
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