Download presentation
Presentation is loading. Please wait.
1
水中大腸菌類之檢測 濾膜法
2
一、方法概要 本方法係用濾膜檢測水中好氧或兼性厭氧、革蘭氏染色陰性、不產芽孢之大腸桿菌群(Coliform group)細菌。該群細菌在含有乳糖的 Endo 培養基上,於 35 ± 1℃ 培養 24 ± 2 小時會產生綠色色系具金屬光澤菌落。所有缺乏金屬光澤的菌落,均判定為非大腸桿菌群。 二、適用範圍 本方法適用於地面水體、地下水體、廢水、污水及海域水質及水源水質水樣中大腸桿菌群之檢測。
3
原理 大腸菌類會分解乳糖產生氣體和醛類,醛類會和鹼性洋紅作用,產生綠色金屬光澤之菌落,一般濾膜菌落,以不超過200個為宜。
4
培養基,應使用市售商品化培養基。 1.LES Endo agar 培養基(又名 m-Endo agar LES 培養基) 每一公升之 LES Endo agar 培養基含下列成份: 酵母抽出物(Yeast extract) 1.2 g 胰化酪蛋白腖(Casitone 或 Trypticase) 3.7 g 胰化蛋白腖(Tryptose) 7.5 g 硫化蛋白腖(Thiopeptone 或 Thiotone) 3.7 g 乳糖(Lactose) 9.4 g 磷酸氫二鉀(K2HPO4) 3.3 g 磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1.0 g 氯化鈉(NaCl) 3.7 g 去氧膽酸鈉(Sodium desoxycholate) 0.1 g 硫酸月桂酸鈉(Sodium lauryl sulfate) 0.05 g 亞硫酸鈉(Na2SO3) 1.6 g 鹼性洋紅(Basic fuchsin) 0.8 g 瓊脂(Agar) 15.0 g 將 51 g m-Endo agar LES培養基粉末置於無菌錐形瓶,加入內含 20 mL 酒精(95%,v/v)之 1 公升試劑水,煮沸溶解後(註:此培養基不可高溫高壓滅菌),冷卻至 45 至 50℃,分裝約 5 mL之培養基至培養皿中(厚度約 3 至 5 mm),置於室溫下凝固後,避光保存於4 ± 2 ℃,保存期限為14天。可根據檢測需求量,依配方比例配製培養基。
5
2. m-Endo broth 培養基 每一公升之 m-Endo broth 培養基含下列成分:
酵母抽出物(Yeast extract) 1.5 g 胰化蛋白腖(Tryptose 或 Polypeptone) 10.0 g 硫化蛋白腖(Thiopeptone 或 Thiotone) 5.0 g 胰化酪蛋白腖(Casitone 或 Trypticase) 5.0 g 乳糖(Lactose) 12.5 g 氯化鈉(NaCl) 5.0 g 磷酸氫二鉀(K2HPO4) g 磷酸二氫鉀(KH2PO4) g 硫酸月桂酸鈉(Sodium lauryl sulfate) 0.05 g 去氧膽酸鈉(Sodium desoxycholate) 0.1 g 亞硫酸鈉(Na2SO3) 2.1 g 鹼性洋紅(Basic fuchsin) 1.05 g 將48 g m-Endo broth培養基粉末置於無菌錐形瓶,加入內含 20 mL 酒精(95%,v/v)之 1 L試劑水,煮沸後(註:此培養基不可高溫高壓高壓滅菌)冷卻,分裝約 1.8 至 2.2 mL 培養液至含無菌吸收襯墊之培養皿中。未分裝之培養液應避光保存於4 ± 2 ℃,保存期限為 96 小時。可根據檢測需求量,依配方比例配製培養基。
6
步驟 (一)水樣在進行檢測或稀釋之前必須劇烈搖晃 25 次以上,以使樣品充分混搖均勻。
(二)視水樣中微生物可能濃度範圍進行水樣稀釋步驟。使用無菌吸管吸取 10 mL之水樣至 90 mL之無菌稀釋液中,形成 10倍稀釋度之水樣,混合均勻。而後自 10 倍稀釋度水樣,以相同操作方式進行一系列適當之 100、1,000、10,000 倍等稀釋水樣,並混搖均勻。進行稀釋步驟時,均需更換無菌吸管。水樣稀釋步驟如附圖所示(註1)。 (三)以無菌鑷子夾起無菌濾膜,放在無菌過濾裝置之有孔平板上,小心將漏斗固定,將過濾裝置接上抽氣幫浦。加入適量無菌稀釋液,以測定過濾設備是否裝置妥當。 (四)以無菌吸管吸取 10 mL的原液及(或)各稀釋度水樣至無菌過濾器中過濾。過濾後,再以 20 至 30 mL 之無菌稀釋液沖洗漏斗;原液及(或)各稀釋度水樣皆需進行二重複。 (五)沖洗過濾後,解開真空裝置,將漏斗移開。儘速以無菌鑷子取出過濾後之濾膜置於培養基上,濾膜應完全與培養基貼合,避免產生氣泡。 (六)將培養皿倒置於 35 ± 1℃ 培養箱內培養 24 ± 2 小時。 (七)若欲進行另一個水樣時,應更換無菌過濾器(漏斗),亦可將過濾器(漏斗)以火烤後降至接近室溫重複使用。 (八)計數各稀釋度培養皿中所產生的金屬光澤菌落,並記錄之。若濾膜上金屬光澤菌落與雜菌菌落之總數超過200個,或是細菌瀰漫生長造成判讀困難,則以「菌落太多無法計數」(Too numerous to count;TNTC)表示,代表此一培養皿無法進行大腸桿菌群定量。
7
(一)以含 20 至 80 個菌落之同一稀釋度的兩個培養皿計算其菌落數,以 菌落數(CFU)/100 mL 表示之。計算公式如下:
結果處理(計算實例請參照附表) (一)以含 20 至 80 個菌落之同一稀釋度的兩個培養皿計算其菌落數,以 菌落數(CFU)/100 mL 表示之。計算公式如下: 註:X、Y:D稀釋度之兩個培養皿的綠色金屬光澤菌落數 D:菌落數在 20 至 80 個之間的稀釋度 (二)培養皿之菌落數不在 20 至 80 個菌落之間時,則依菌落數實際數目以下列方式處理: 1.若原液及各稀釋水樣中僅有一個稀釋度的一個培養皿菌落數在 20 至 80 個之間,則以上述公式計算之。 2.若原液培養皿中均無菌落生長,則菌落數以小於 10(<10)表示;若僅原液有菌落產生且少於 20 個,亦應計數菌落數。 3.若各培養皿之菌落數均不在 20 至 80 個之間,則選取最接近80個菌落數之同一稀釋度的兩個培養皿以上述公式計算。 (三)數據表示:若計算所得之菌落數小於 10,以「<10」表示;菌落數小於 100 時,以整數表示(小數位數四捨五入),菌落數大於 100 以上時,只取兩位有效數字,例如菌落數為 142 時以 1.4 x 102 表示之,菌落數 155 時以 1.6 x 102 表示之,菌落數為 時以1.9 x 104 表示。 (四)檢測紀錄須註明採樣時間、培養起始及終了時間、培養基名稱、培養溫度及各稀釋度的原始數據等相關資料。
8
圖一 水樣稀釋步驟 圖一 水樣稀釋步驟
9
表一、大腸桿菌群計算實例說明 畫底線數字表示用於計數 表一、大腸桿菌群計算實例說明 培養皿中之金屬光澤菌落 稀釋1000倍 (原液0.01)
結果表示 (菌落數(CFU)/100mL) 原液10mL 稀釋10倍 (原液1mL) 稀釋100倍 (原液0.1mL) 參考 TNTC;TNTC 75;70 6;7 1;0 7.3x103 八、(一) 21;17 3;4 0;0 1.9x103 八、(二)1 90;85 11;9 8.8x104 八、(二)3 5;3 40 八、(二)2 <10 註: TNTC表示菌落太多,計數困難 畫底線數字表示用於計數 畫底線數字表示用於計數
10
濾膜法與多管發酵法之優缺點比較: 優點: 1. 短時間可獲得結果; 2. 可增加水樣靈敏度較高具代表 性; 3. 培養基配置簡單; 4. 水樣不需特別處理; 5. 再現性高可直接計數; 6. 經費較節省。 缺點: 1. 水中濁度太高不適合使用; 2. 若有有毒物質會吸附或濃縮於濾 膜上,不適合使用; 3. 易受環境污染影響數據。
11
說明 本實驗僅選定3個連續濃度,因此僅需6個培養基,以每個培養基約要25mLM-endo agar,共約要150mL之培養基。 M-endo培養基不能用高溫高壓滅菌法,又因要加入少許酒精,因此加熱時瓶蓋不得旋緊,以免爆炸。(加熱時外部要用紙箱圍著,以防萬一!) 全程使用手套。
Similar presentations