水中大腸菌類之檢測 濾膜法.

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1 水中大腸菌類之檢測 濾膜法

2 一、方法概要 本方法係用濾膜檢測水中好氧或兼性厭氧、革蘭氏染色陰性、不產芽孢之大腸桿菌群（Coliform group）細菌。該群細菌在含有乳糖的 Endo 培養基上，於 35 ± 1℃ 培養 24 ± 2 小時會產生綠色色系具金屬光澤菌落。所有缺乏金屬光澤的菌落，均判定為非大腸桿菌群。 二、適用範圍 本方法適用於地面水體、地下水體、廢水、污水及海域水質及水源水質水樣中大腸桿菌群之檢測。

3 原理 大腸菌類會分解乳糖產生氣體和醛類，醛類會和鹼性洋紅作用，產生綠色金屬光澤之菌落，一般濾膜菌落，以不超過200個為宜。

4 培養基，應使用市售商品化培養基。 1.LES Endo agar 培養基（又名 m-Endo agar LES 培養基） 每一公升之 LES Endo agar 培養基含下列成份： 酵母抽出物（Yeast extract） 1.2 g 胰化酪蛋白腖（Casitone 或 Trypticase） 3.7 g 胰化蛋白腖（Tryptose） 7.5 g 硫化蛋白腖（Thiopeptone 或 Thiotone） 3.7 g 乳糖（Lactose） 9.4 g 磷酸氫二鉀（K2HPO4） 3.3 g 磷酸二氫鉀（KH2PO4） 1.0 g 氯化鈉（NaCl） 3.7 g 去氧膽酸鈉（Sodium desoxycholate） 0.1 g 硫酸月桂酸鈉（Sodium lauryl sulfate） 0.05 g 亞硫酸鈉（Na2SO3） 1.6 g 鹼性洋紅（Basic fuchsin） 0.8 g 瓊脂（Agar） 15.0 g 將 51 g m-Endo agar LES培養基粉末置於無菌錐形瓶，加入內含 20 mL 酒精（95%，v/v）之 1 公升試劑水，煮沸溶解後（註：此培養基不可高溫高壓滅菌），冷卻至 45 至 50℃，分裝約 5 mL之培養基至培養皿中（厚度約 3 至 5 mm），置於室溫下凝固後，避光保存於4 ± 2 ℃，保存期限為14天。可根據檢測需求量，依配方比例配製培養基。

5 2. m-Endo broth 培養基 每一公升之 m-Endo broth 培養基含下列成分：
酵母抽出物（Yeast extract） 1.5 g 胰化蛋白腖（Tryptose 或 Polypeptone） 10.0 g 硫化蛋白腖（Thiopeptone 或 Thiotone） 5.0 g 胰化酪蛋白腖（Casitone 或 Trypticase） 5.0 g 乳糖（Lactose） 12.5 g 氯化鈉（NaCl） 5.0 g 磷酸氫二鉀（K2HPO4） g 磷酸二氫鉀（KH2PO4） g 硫酸月桂酸鈉（Sodium lauryl sulfate） 0.05 g 去氧膽酸鈉（Sodium desoxycholate） 0.1 g 亞硫酸鈉（Na2SO3） 2.1 g 鹼性洋紅（Basic fuchsin） 1.05 g 將48 g m-Endo broth培養基粉末置於無菌錐形瓶，加入內含 20 mL 酒精（95%，v/v）之 1 L試劑水，煮沸後（註：此培養基不可高溫高壓高壓滅菌）冷卻，分裝約 1.8 至 2.2 mL 培養液至含無菌吸收襯墊之培養皿中。未分裝之培養液應避光保存於4 ± 2 ℃，保存期限為 96 小時。可根據檢測需求量，依配方比例配製培養基。

6 步驟 （一）水樣在進行檢測或稀釋之前必須劇烈搖晃 25 次以上，以使樣品充分混搖均勻。
（二）視水樣中微生物可能濃度範圍進行水樣稀釋步驟。使用無菌吸管吸取 10 mL之水樣至 90 mL之無菌稀釋液中，形成 10倍稀釋度之水樣，混合均勻。而後自 10 倍稀釋度水樣，以相同操作方式進行一系列適當之 100、1,000、10,000 倍等稀釋水樣，並混搖均勻。進行稀釋步驟時，均需更換無菌吸管。水樣稀釋步驟如附圖所示（註1）。 （三）以無菌鑷子夾起無菌濾膜，放在無菌過濾裝置之有孔平板上，小心將漏斗固定，將過濾裝置接上抽氣幫浦。加入適量無菌稀釋液，以測定過濾設備是否裝置妥當。 （四）以無菌吸管吸取 10 mL的原液及（或）各稀釋度水樣至無菌過濾器中過濾。過濾後，再以 20 至 30 mL 之無菌稀釋液沖洗漏斗；原液及（或）各稀釋度水樣皆需進行二重複。 （五）沖洗過濾後，解開真空裝置，將漏斗移開。儘速以無菌鑷子取出過濾後之濾膜置於培養基上，濾膜應完全與培養基貼合，避免產生氣泡。 （六）將培養皿倒置於 35 ± 1℃ 培養箱內培養 24 ± 2 小時。 （七）若欲進行另一個水樣時，應更換無菌過濾器（漏斗），亦可將過濾器（漏斗）以火烤後降至接近室溫重複使用。 （八）計數各稀釋度培養皿中所產生的金屬光澤菌落，並記錄之。若濾膜上金屬光澤菌落與雜菌菌落之總數超過200個，或是細菌瀰漫生長造成判讀困難，則以「菌落太多無法計數」（Too numerous to count；TNTC）表示，代表此一培養皿無法進行大腸桿菌群定量。

7 （一）以含 20 至 80 個菌落之同一稀釋度的兩個培養皿計算其菌落數，以 菌落數（CFU）/100 mL 表示之。計算公式如下：
結果處理（計算實例請參照附表） （一）以含 20 至 80 個菌落之同一稀釋度的兩個培養皿計算其菌落數，以 菌落數（CFU）/100 mL 表示之。計算公式如下： 註：X、Y：D稀釋度之兩個培養皿的綠色金屬光澤菌落數 　　D：菌落數在 20 至 80 個之間的稀釋度 （二）培養皿之菌落數不在 20 至 80 個菌落之間時，則依菌落數實際數目以下列方式處理： 1.若原液及各稀釋水樣中僅有一個稀釋度的一個培養皿菌落數在 20 至 80 個之間，則以上述公式計算之。 2.若原液培養皿中均無菌落生長，則菌落數以小於 10（＜10）表示；若僅原液有菌落產生且少於 20 個，亦應計數菌落數。 3.若各培養皿之菌落數均不在 20 至 80 個之間，則選取最接近80個菌落數之同一稀釋度的兩個培養皿以上述公式計算。 （三）數據表示：若計算所得之菌落數小於 10，以「＜10」表示；菌落數小於 100 時，以整數表示（小數位數四捨五入），菌落數大於 100 以上時，只取兩位有效數字，例如菌落數為 142 時以 1.4 x 102 表示之，菌落數 155 時以 1.6 x 102 表示之，菌落數為 時以1.9 x 104 表示。 （四）檢測紀錄須註明採樣時間、培養起始及終了時間、培養基名稱、培養溫度及各稀釋度的原始數據等相關資料。

8 圖一 水樣稀釋步驟 圖一 水樣稀釋步驟

9 表一、大腸桿菌群計算實例說明 畫底線數字表示用於計數 表一、大腸桿菌群計算實例說明 培養皿中之金屬光澤菌落 稀釋1000倍 （原液0.01）
結果表示 （菌落數（CFU）/100mL） 原液10mL 稀釋10倍 （原液1mL） 稀釋100倍 （原液0.1mL）  參考 TNTC；TNTC 75；70 6；7 1；0 7.3x103  八、（一） 21；17 3；4 0；0 1.9x103  八、（二）1 90；85 11；9 8.8x104  八、（二）3 5；3 40  八、（二）2 <10 註： TNTC表示菌落太多，計數困難 畫底線數字表示用於計數 畫底線數字表示用於計數

10 濾膜法與多管發酵法之優缺點比較: 優點: 1. 短時間可獲得結果； 2. 可增加水樣靈敏度較高具代表 性； 3. 培養基配置簡單； 4. 水樣不需特別處理； 5. 再現性高可直接計數； 6. 經費較節省。 缺點: 1. 水中濁度太高不適合使用； 2. 若有有毒物質會吸附或濃縮於濾 膜上，不適合使用； 3. 易受環境污染影響數據。

11 說明 本實驗僅選定3個連續濃度，因此僅需6個培養基，以每個培養基約要25mLM-endo agar，共約要150mL之培養基。 M-endo培養基不能用高溫高壓滅菌法，又因要加入少許酒精，因此加熱時瓶蓋不得旋緊，以免爆炸。(加熱時外部要用紙箱圍著，以防萬一!) 全程使用手套。