蛋白质综合性实验 白蛋白的分离纯化与鉴定 生物化学教研室.

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1 蛋白质综合性实验 白蛋白的分离纯化与鉴定 生物化学教研室

2 蛋白质盐析 葡聚糖凝胶Ｇ--25脱盐 DEAＥ－Sephadex离子交换纯化 蛋白质浓度检测 SDS— PAGE电泳法 （鉴定蛋白质纯度和分子量）

3 实验操作： 盐析： 上清：白蛋白 0.5ml血清 混匀 0.5ml饱和 硫酸铵 沉淀：球蛋白 5000rpm离心10min
将上清转移另一Ep管(尽可能吸尽上清).待用 沉淀+0.6mlddH2O溶解， 5000rpm5min离心，留上清液备用.

4 葡聚糖凝胶柱层析 清洗层析柱，垂直安装好层析柱，装入蒸馏水,检查是否漏液；层析柱内是否有气泡 。如果有气泡，必须想办法排除
装柱：；悬浮葡聚糖凝胶，装入柱中，凝胶边沉降，边加入凝胶。床内不得有界面和气泡。床上表面平整。 平衡：接恒压储液瓶，用0.02M缓冲液洗脱平衡。调节流速1ml/min；设定自动部分收集器的收集时间（2ml/tube）。 层析床检查：床内不得有界面和气泡。床上表面平整。兰色的葡聚糖2000进行层析行为的检查 加样及洗脱： 收集和测定：用自动部分收集器． 清洗平衡：收取蛋白后继续用缓冲液洗脱约2个柱体积，也可用考马斯亮兰检测无蛋白质的流出液。

5 离子交换柱层析(DE-52) 清洗层析柱,垂直安装好层析柱,检查是否漏液与气泡。 装柱：悬浮液装柱；介质高度8-10cm.
平衡：缓冲液洗脱平衡（至少10倍柱体积）。调节流速0.5ml/min；设定自动部分收集器的收集时间（2ml/tube） 加样:第一次上球蛋白．第二次上白蛋白 洗脱：第一次用0.02mol/L、0.06mol/L、 NH4Ac梯度洗脱球蛋白.第二次用0.3 mol/L NH4Ac梯度洗脱白蛋白。 收集和测定：自动部分收集器． 2ml/tube 清洗再生：1.5mol/L NaCl+0.3mol/L NH4Ac缓冲液洗脱。

6 注意事项： 1、严防空气进入层析柱发生裂柱现象，小心控制液体出口，使缓冲液刚好降到柱床表面。
2、保持层析柱床表面的完整，上样或加缓冲液时要小心、 缓慢。 3、洗脱时注意记录仪上的蛋白质洗脱峰与收集管之间的对应关系。

7 恒压高位槽 主要作用：保证整个系统压力的恒定。

8 蛋白质自动分析收集系统 HD—3紫外检测仪 BSZ-100自动部份收集器 LM17型记录仪使用说明

9 HD—3紫外检测仪 （监测具有紫外吸收物质的检测仪器 。）

10 操作步骤： 2．将波长旋钮(在仪器的右侧)旋到所需波长刻度。如蛋白280nm、核酸254nm.
1．在仪器使用前，首先检查检测仪、记录仪的电路连接正确，然后接到220V的电源上。 2．将波长旋钮(在仪器的右侧)旋到所需波长刻度。如蛋白280nm、核酸254nm. 4．按下检测仪“电源”开关。如果灯亮，表示光源已开始工作，整台仪器进入工作状态。

11 操作步骤： 5．把“灵敏度”旋钮选择到“100％”档，调节“光量”旋钮，检测仪数字显示为100，即透光率为100％。
6．再把“灵敏度”开关旋到所需档（使用者自行掌握），缓慢调节“调零”旋钮，使记录仪指针在“0”位，检测仪数字显示为“0”。以上步骤需反复调节几次，待层析系统平衡后，即可加样检测。 7.在样品检测过程中，不可再调节“调零”、“光量”旋钮。如绘出的图谱即出峰过小，可改变“灵敏度”选择档，每档成两倍放大关系。

12 BSZ-100自动部份收集器 （自动定时收集层析液，从而代替手工操作，提高工作效率 ）

13 操作步骤： （1）定位： A、按“复位”键，仪器自动复位至起点后“报警”，再按“复位”键，仪器自动复位。
B、把“安全阀”上“横杆”一头中的硅胶管对准第一根试管中心位置(外圈第一根试管)。对准后固定好各自的固定螺钉。在自动收集过程中，不允许移动硅胶管出口的位置!

14 （2）设置定时时间 A、按下“手动/自动”键，指示灯不亮，仪器处于“手动”状态。
B、按“选择”键选定设定时间数字的位置，每按一次向后移动一个位置。当数字闪烁时，可通过“置数”键设置该位的时间值，设置顺序从高到低，设置好各位的值后，再按一次“选择”键，此时的数值就是定时时间。(时间单位：分钟)

15 （3）自动收集 A、按“切换”键，“收集”指示灯亮，仪器处于“收集”工作状态。
B、按“手动／自动”键，指示灯亮，仪器处于自动收集状态，定时时间在1小时之内，以秒递减至零；定时时间在l—24小时之内，以分递减至零，仪器自动转一管，然后重新开始计时。自动收集时，如要检查设置的定时时间，只需按一下“切换“键，就能显示设置的定时时间(显示3秒钟后自动返回)。 C、停止收集，可按“手动／自动”键，使仪器处于手动状态，或关闭电源开关。

16 LM17型记录仪 （记录紫外检测仪的信号）

17 使用方法： 1．  1、装上记录纸和记录笔（由教师操作）。 2、打电源开关。 3、零位调节：按“量程/零位”切换按键，当零位指示灯亮时，数码管显示为“Po”，此时仪器处于零位调节状态。在零位调节状态下，按下“左移”或“右移”按键不放，使记录笔移至所需的零位。

18 使用方法：  4、 量程选择：按“量程/零位”切换按键，当量程指示灯亮时，表示当前操作为量程选择，数码管显示当前量程范围：V、mV指示当前量程的单位。HD-3紫外检测仪的量程为10mV。 5．  取下记录笔的塑料笔套，压下“抬/落笔手柄”（不要强力按压笔尖，以避免笔尖损坏或变粗）。实验结束后，将塑料笔套套上，以避免墨水蒸发。 6．  走纸速度选择：按“启/停”切换按键，当纸速显示数码管闪烁时，表示走纸停止，此时按“调速”键调节选择走纸的速度。确定后按“启/停”键，数码管不再闪烁时，仪器即开始记录。（一般为0.2mm/min ）

19 考马斯亮蓝G-250法检测蛋白质浓度 1．按下表配置溶液 100 60 1管 3管 4管 5管 7管 测定管 2管 20 100 40 60
6管 蛋白质标准溶液1mg/mL（µl ） 100.0样品 20 100 40 60 80 100 80 60 20.0 0.0 蒸馏水（µl ） 40.0 0.0 考马斯亮蓝溶液（ml） 3 3 3 3 3 3 3 充分混匀后以1管调零，在595nm处测定各管吸光度。

20 制作标准曲线： 以浓度为横坐标，吸光度An作纵坐标，做标准曲线。 在标准曲线上查出检测管的蛋白质浓度。

21 注意事项： 1、标准曲线和检测管吸光度的检测应在同样的条件下进行。 2、蛋白质浓度过高时，易发生沉淀，故应尽可能在10min内完成检测。

22 蛋白质垂直板SDS-PAGE电泳 （目的：鉴定蛋白质的纯度、蛋白质的分子量）

23 聚丙烯凝胶电泳的原理： 浓缩效应 分子筛效应 电荷效应

24 SDS-聚丙烯凝胶电泳 SDS，带负电荷。破坏蛋白质的氢键、疏水键，形成单个亚基。

25 试剂： 分离胶缓冲液(1号)：1N HCl 48.0ml与Tris36.3g加蒸馏水到100ml，pH8.9。
单体交联剂(2号)：丙烯酰胺30.0g与甲叉双丙烯酰胺0.8g加蒸馏水到100ml。 催化剂(3号)：10%过硫酸铵(AP)，临用前配制100mg/ml。 加速剂(4号)：四甲基乙二胺(TEMED)1ml加蒸馏水稀释到10ml。

26 试剂： 电极缓冲液(6号)：甘氨酸28.8g与Tris6.0g加蒸馏水到100ml，临用前按1：10比例稀释，pH8.3。 上样缓冲溶液(7号)： 固定染色液(9号)：氨基黑10B0.5g，用7%醋酸液稀释到100ml。 漂洗液(10号)：冰醋酸7ml加蒸馏水蒸馏至100ml。

27 凝胶缓冲液配制表 试剂 分离胶溶液（ml） 浓缩胶溶液（ml） 1号 1.60 —— 2号 2.50 1.0 10%SDS 0.10 0.1
1号 —— 2号 10%SDS 蒸馏水 5号 —— 3号 4号 总体积 浓度（%）

28 分离胶的制备： (1)按分离胶配制表的比例(见前表)，混匀后即成为分离胶溶液。。
(2) 吸取分离胶溶液，将其沿玻璃壁缓慢注入凝胶室内，液面高度至玻璃板上端1厘米。注意排出气泡。(此溶液约在一小时内聚合为聚丙烯酰胺凝胶) （3）待浓缩胶聚合后，小心取出梳子，注意千万不要破坏样品槽。上提斜木契板让其松开。取下凝胶密封框。将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽内。插入斜契板。

29 （3）加样： 将电泳液加至内槽凹口以上，外槽电泳液加至平板玻璃上缘3mm处。 将样品和上样缓冲液按比例混合，小心地加入样品槽。注意每个样品槽中蛋白质的量应不少于10mg，以利于染色后观察。

30 （4）电泳 盖好电泳槽盖子。正确连接电泳槽与电泳仪的正负极。
样品在浓缩胶中电泳时，每块胶以8mA的电流恒流电泳，若两块胶在同一电泳槽同时电泳，电流量加倍。在浓缩胶与分离胶的交界面，蛋白质样品被压缩成一条窄带。 当示踪染料进入分离胶后，每块胶的电流增加到18mA. 待示踪染料迁移至胶底时，关掉电源，停止电泳。

31 （5）染色及漂洗： 将剥出的凝胶浸入9号试剂中泡30分钟，进行固定染色，然后用清水冲洗 掉多余的染料。
放入10号试剂中漂洗脱色，在此过程中应经常更换漂洗液，直至背景几乎无色为止，需时约1-2天。脱色后的胶柱放在7％醋酸溶液中可长期保存。 将凝胶进行拍照，结果留存。

32 实验记录 实验各操作步骤 实验中观察到的现象 实验结果：记录的图纸；凝胶分析结果