Enzyme 2-1:澱粉酶活性之測定 2017/3/12.

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1 Enzyme 2-1:澱粉酶活性之測定 2017/3/12

2 目的： 利用澱粉酶可分解澱粉形成葡萄糖、麥芽糖等小分子還原糖的功能，藉由本氏液判定是否有糖類生成 2017/3/12

3 本氏液 (Benedict’s solution)：
17.3 g 硫酸銅（CuSO4） 173 g 檸檬酸鈉 (Sodium Citrate ) 100 g 碳酸鈉 (Na2CO3) + dd H2O ~~ 1L 檸檬酸鈉錯合銅離子 與還原糖反應 Cu Cu+ 顏色變化： 藍 → 藍綠 → 綠 → 褐 → 橙 → 紅 (Cu2O) 還原糖之多寡： 少 多 2017/3/12

4 原理： Benedict’s solution內含之Cu 2+會被還原糖的官能基還原形成Cu2O之紅色沉澱，可藉此偵測還原糖的濃度與存在與否
2017/3/12

5 步驟： 各加入1 ml 3%澱粉液 c:加入1 ml ddH2O a:加入1 ml 3% b:加入1 ml新鮮唾液 α-amylase
放置加熱器反應37℃ 30 min a b c a、b、c 3個試管各加入10滴的本氏液 置於水浴加熱並觀察各管顏色之變化 2017/3/12

6 預期結果： a b c 紅棕色 問題： 詳述澱粉結構與種類？ 澱粉酶種類有哪些？ 2017/3/12

7 Enzyme 2-2 :澱粉酶最適pH之測定 2017/3/12

8 目的： 利用不同pH值測試澱粉酶分解澱粉形成葡萄糖、麥芽糖等小分子還原糖之效力，並藉由DNS呈測法判定糖類生成之濃度來判斷澱粉酶之最適pH值
2017/3/12

9 DNS (3,5-dinitrosalicylic acid)
3,5-二硝基水楊酸 (3,5-dinitrosalicylic acid, DNS）試劑之反應是利用DNS具還原力之特性，因此碳水化合物只要具有游離或游離趨勢之醛或酮基，即能在鹼性溶液下有還原的能力而進行以下反應： 鹼性環境下： 3,5-dinitrosalicylic acid （yellow） 3-amino-5-nitrosalicylic acid （orange-red） reduction COO- OH NH2 O2N NO2 2017/3/12

10 原理： 利用澱粉酶可分解澱粉之作用(如下)： α-amylase 葡萄糖、麥芽糖、異麥芽糖 澱粉 及6~9個葡萄糖組成的寡糖 可切斷澱粉中
α-1,4糖苷鍵 並藉由在不同pH值的條件下，利用還原糖的測定(DNS呈色法)，以分光光度計在OD540nm條件下測定吸光值，進而得知酵素最適pH值。 2017/3/12

11 再將各管分別加入100 μl DNS reagent，沸水浴5 min
步驟-1： a b c d e f 取6支試管 (1)先各加入 500 μl 1% 澱粉液 (2)再各加入 200 μl 100 mM磷酸緩衝液(pH=5,6,7,8,9) 以及ddH2O (3)最後各加入100 μl 1% NaCl 將各試管放置37℃下，預溫5 min * a~e管各加入100 μl 1% α-amylase. * f 管 加入100 μl ddH2O 37℃下反應30 min 再將各管分別加入100 μl DNS reagent，沸水浴5 min 測OD540下吸光值 2017/3/12

12 預期結果： 澱粉酶之最適pH為何？ 2017/3/12

13 問題： 酵素與基質有哪些關係 影響酵素作用的可能因子有哪些？ 原因為何？ 2017/3/12