实验五 　从牛奶中分离奶油、酪蛋白和乳糖.

Presentation on theme: "实验五 　从牛奶中分离奶油、酪蛋白和乳糖."— Presentation transcript:

1 实验五 　从牛奶中分离奶油、酪蛋白和乳糖

2 牛奶的化学成分很复杂，至少有100多种，主要成分由水、脂肪、磷脂、蛋白质、乳糖、无机盐等组成。一般牛奶的主要化学成分含量为： 水分：87
牛奶的化学成分很复杂，至少有100多种，主要成分由水、脂肪、磷脂、蛋白质、乳糖、无机盐等组成。一般牛奶的主要化学成分含量为： 　　水分：87.5% 　　脂肪：3.5% 　　蛋白质：3.4% 　　乳糖：4.6% 　　无机盐：0.7% 组成人体蛋白质的氨基酸有20种，其中有8种是人体本身不能合成的，这些氨基酸称为必需氨基酸。我们进食的蛋白质中如果包含了所有的必需氨基酸，这种蛋白质便叫作全蛋白。

3 牛奶中的蛋白质便是全蛋白。 牛奶中的无机盐也称矿物质。牛奶中含有Ca2+、Mg2+、K+、Fe3+等阳离子和PO43-、SO42-、Cl-等阴离子；此外还有微量元素I、Cu、Zn、Mn等。这些元素绝大部分都对人体发育生长和代谢调节起着重要作用。钙是人体中含量最高的无机盐，是构成骨骼和牙齿的主要成分。人体中90%的钙集中在牙齿和骨骼上。儿童、青少年生长发育需要充足的钙，同样孕妇及成人、中老年人，也需要补充钙质，缺乏钙会影响牙齿和骨骼的正常发育，导致佝偻病。

4 干酪素是等电点为pH4.6的两性蛋白质。在牛奶中以磷酸二钙、磷酸三钙或两者的复合物形式存在，构造极为复杂，直到现在没有完全确定的分子式，分子量大约为 。干酪素在牛奶中约含3%，约占牛奶蛋白质的80%。纯干酪素为白色、无味、无臭的粒状固体。相对密度约1.26。不溶于水和有机溶剂。

5 大自然中的钙是以化合态存在的，只有被动、植物吸收后形成具有生物活性的钙，才能更好地被人体所吸收利用。牛奶中含有丰富的活性钙，是人类最好的钙源之一，1升新鲜牛奶所含活性钙约1250毫克，居众多食物之首，约是大米的101倍、瘦牛肉的75倍、瘦猪肉的110倍，它不但含量高，而且牛奶中的乳糖能促进人体肠壁对钙的吸收，吸收率高达98%，从而调节体内钙的代谢，维持血清钙浓度，增进骨骼的钙化。吸收好对于补钙是尤其关键的。故"牛奶能补钙"这一说法是有其科学道理的。

6 一、实验目的 1．从牛乳中提取奶油、酪蛋白及乳糖。 2．对酪蛋白进行纯化。 3．掌握考马斯亮蓝法测定含量。

7 二、实验原理 牛奶含有半乳糖、蛋白质、脂肪成份。蛋白质主要是酪蛋白，含量约为35g/l。酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸钙-磷酸钙复合体胶粒存在，胶粒直径约为20～800纳米，平均为100纳米。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白会沉淀，加工后可制得干酪或干酪素。本实验利用加酸，当达到酪蛋白等电点PH=4.7时，酪蛋白沉淀。再通过离心而获得的沉淀即为酪蛋白，沉淀物中所含的脂肪通过有机溶剂抽提而去除，最终得到纯白色、晶状酪蛋白。剩下的液体为乳清，在乳清中含有乳白蛋白和乳球蛋白，还有溶解状态的乳糖，乳清中糖类的99.8%以上是乳糖，可通过浓缩、结晶制取乳糖。

8 　　考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。在高浓度时线性关系较差。

9 三、实验材料、主要仪器和试剂 1． 实验材料 牛奶、200目的尼龙布 2．主要仪器：离心机、、离心管、水浴锅、pH计、具塞试管、试管架、烧杯、量筒、微量取样器、分光光度计

10 3．试剂：0.2 mol/L HAc-Na buffer、95%乙醇、乙醚、
　（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1 000μg／mL的原液。 　（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。 　　（3）乙醇 　　（4）磷酸（85％）

11 四、操作步骤 1．奶油的制备： 牛奶中的脂肪含量在3．4％～3．8％之间，以极微小微明的小球悬浮于乳的液体内，由于比重小，一般都聚集在奶的表层。 （1）从牛奶中分离生奶油：取80ml鲜奶，离心后取出上层奶油。奶油放入冰箱。 （2）24小时后从冰箱中取出奶油，搅打观察其变化并记录。

12 2．酪蛋白的制备： （1）取10mL脱脂牛奶加热到40℃，倒人50ml离心管中，在搅拌下慢慢加入预热到40℃、PH4．6的o．2mo1／L乙酸—乙酸钠缓冲液10mL、用pH试纸或酸度计检验，混合物的最后PH应是4．7。 （2）将上述悬浮液冷却至室温，离心5min(5000r／min)。弃去上清液，得酯蛋白粗制品(沉淀物)。

13 　（3）纯化： 用水洗沉淀2次；向沉淀中加入20ml左右的水(用玻棒将沉淀充分打碎)，离心5min(5000r／min)，弃去上清液。 用乙醇、无水乙醚洗涤沉淀：在沉淀中加入20mL 95％乙醇，搅拌片刻(尽可能充分地把沉淀块状打碎)，将全部悬蚀浓转移至布氏漏斗中抽滤。用无水乙醇—无水乙醚混合液（等体积）洗沉淀2次，抽干。最后用无水乙醚洗沉淀2次，抽干。 (4)将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白纯品。

14 3. 从牛奶中分离乳糖 牛奶中的乳糖含量为4．5％，是乳中的特有产物。
（1）在除去酪蛋白的乳清中，加入1.5g CaCO3粉末，搅拌均匀后加热至沸。加CaCO3的目的一方面是中和溶液的酸性，防止加热时乳糖水解，另方面又能使乳白蛋白沉淀。 （2）过滤除去沉淀，在滤液中加入1～2粒沸石，加热浓缩至3～5ml，加入10ml 95%乙醇（注意离开火焰）和少量活性炭，搅拌均匀后在水浴上加热至沸腾，趁热过滤，滤液必须澄清。

15 （3）加塞放置过夜，乳糖结晶析出，抽滤，用95%乙醇洗涤产品。 （4） 乳糖成脎试验
取自制乳糖溶于少量水中，浓度约为5%，在试管中加入1ml乳糖溶液，1ml苯肼试剂，摇匀，试管口用棉花塞住，在沸水浴中加热，并不时振摇，加热10～15分钟后，取出放置冷却，乳糖脎成结晶析出。取少量乳糖脎在显微镜下观察其结晶形态，可证实为乳糖。 ①苯阱试剂有毒，小心使用，勿触及皮肤，如触及皮肤先用稀醋酸洗，再用水洗。（选做） 　（5）旋光法测定含量（选做） 见资料中nunai

16 4．计算酪蛋白的质量浓度和得率 准确称量从牛奶中分离出的酷蛋白纯品。 (1)计算酪蛋白实际的质量浓度
实际质量浓度以1L，牛奶中酪蛋白的质量(g)表示。 (2)计算得率 酪蛋白得率／％＝酪蛋白实际的质量浓度/酪蛋白的理论质量浓度×100 式中：牛奶中酪蛋白的理论质量浓度为35g/L

17 5．酪蛋白纯度测定 － 考马斯亮蓝法 1．标准曲线制作
（1）0~100μg／mL标准曲线的制作：取6支10mL干净的具塞试管，按表1取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。

18 表1 低浓度标准曲线制作 管 号 1 2 3 4 5 6 1 000μg／mL标准蛋白液（mL） 0.02 0.04 0.06 0.08
表1 低浓度标准曲线制作 管 号 1 2 3 4 5 6 1 000μg／mL标准蛋白液（mL） 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 蒸馏水（mL） 1.00 0.98 0.96 0.94 0.92 0.90 考马斯亮蓝G-250试剂（mL） 蛋白质含量（μg） 20 40 60 80 100 OD595nm

19 （2）0~1 000μg／mL标准曲线的制作：另取6支10mL具塞试管，按表2取样。其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为0~1 000μg／mL的标准曲线。
表2 高浓度标准曲线制作 管 号 7 8 9 10 11 12 1 000μg／mL标准蛋白液（mL） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（mL） 1.00 考马斯亮蓝G-250试剂（mL） 5 蛋白质含量（μg） 200 400 600 800 1 000 OD595nm

20 2．酪蛋白浓度测定 （1）待测样品制备：称取上述制备的酪蛋白100mg,定容至100ml。

21 （2）测定：另取2支10mL具塞试管，按下表取样。吸取提取液0
（2）测定：另取2支10mL具塞试管，按下表取样。吸取提取液0.1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（μg）。以标准曲线1号试管做空白。

22 表3 待测液蛋白质浓度测定 管 号 13 14 蛋白质待测样品提取液（mL） 0.1 0.9 5 蒸馏水（mL）
管 号 13 14 蛋白质待测样品提取液（mL） 0.1 0.9 5 蒸馏水（mL） 考马斯亮蓝G-250试剂（mL） OD595nm 蛋白质含量（μg）

23 五、结果计算 X ×1000 = 酪蛋白含量 （g / g） 100 式中：X为在标准曲线上查得的蛋白质含量（μg）。

24 六、注意事项 1、牛奶与缓冲液要预热 2、缓冲液要缓加缓搅 3、在滤纸上样品的脱脂过程要搅动，不得搅破滤纸
4、实验环境要保持空气流通，门窗要开 5、酪蛋白等电点随温度不同而变化,等电点pH为4.6～4.8。分离酪蛋白时,边加醋酸边搅拌,边测pH,同时观察沉淀。开始快搅拌,接近等电点时,应慢搅拌。

25 6、酪蛋白沉淀用200目的尼龙布过滤比较好,同时进行抽滤。用滤纸很难过滤;而用纱布过滤,酪蛋白容易粘在其上。
7、用乙醇和乙醚清洗酪蛋白沉淀时,应将酪蛋白捣碎,并在溶剂中搅拌、浸泡,充分洗净脂肪。纯净的酪蛋白应为白色,若发黄表明脂肪未洗干净。

26 七、思考题 1.在酪蛋白制备时为什么要用醋酸缓冲液调pH到4.8？ 2.乙醚、乙醇作用是什么？
3. 制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合？ 将各试管中溶液纵向倒转混合目的是使反应充分，并且使整个反应液均一，否则在比色测定时，结果会有较大偏差，使标准曲线的制作不标准， 后续的测定结果就不可靠。