第 5 章 荧光光谱 5.1 基本原理 5.2 荧光探测 5.3 荧光光谱的应用 1/45

5.1 基本原理  光致发光 ，发射光谱，吸收 + 发射  光致发光可以在紫外 - 可见光区、 X 射线区等 2/45

5.1.1 荧光发光原理 3/45

光致发光的能级向下跃迁过程 ①无辐射跃迁：激发态 → 第一电子激发态的最低能级 在激发态因碰撞以热的形式损失能量，跃迁到第一电子 激发态的最低能级 ②荧光发射：第一电子激发态的最低能级 → 基态能级 由第一电子激发态的最低能级跃迁至基态，光的形式释 放能量，即荧光 ③磷光发射：三重态 → 基态能级 先无辐射跃迁至三重态，逗留较长时间后再跃迁至基态 能级，发射磷光 4/45

荧光与磷光的区别  从激发态跃迁到基态的路径不同  从激发到发光的时间不同，荧光 ~10 -7 s 磷光 ~10s ( 三重态是亚稳态 )  发光波长不同，荧光波长比磷光波长短 5/45

5.1.2 荧光光谱与吸收光谱 6/45

紫外 - 可见吸收光谱荧光光谱 光谱类型吸收光谱发射光谱 波长范围紫外 nm ，可见 nm 探测灵敏度不如荧光光谱高 ppb 量级， 产生机理电子能级跃迁，一次跃 迁，吸收 电子能级跃迁，两次跃 迁，吸收 + 激发 光谱形状带状、连续 呈镜像关系，荧光谱带波长比吸收谱带波长长 吸收光谱可能存在多套光谱 7/45

5.1.3 产生荧光的基本条件  入射光要能被物质粒子吸收，使粒子能够跃迁到激 发态，然后经第一电子激发态的最低能级，降落到基态 振动能级  物质粒子要具有高的荧光效率 荧光过程速率常数， 由物质粒子本身决定 8/45

 具有大共轭双键的分子容易发射荧光， π→π* 跃迁的 量子效率高，寿命短（ ~10 -7 s ）  共轭效应越大，荧光效率越高，苯 < 萘 < 蒽 苯 萘 蒽 分子结构与荧光效率 9/45

 刚性平面分子荧光效率更高，会减小分子振动，从而 减小与其它分子碰撞的可能，芴 ≈ 1.0 > 联苯 0.18 芴 联苯 10/45

无荧光 水杨酸 有荧光 氢键形成平面刚性结构！ 11/45 OH O O

 取代基也会影响荧光效率 给电子基 (-NH 2, OH) 会增强荧光效率（共轭作用） 吸电子基 (-NO 2, -C=O, -C=NH) 会减弱甚至猝灭荧光 取代基的空间阻碍作用会减弱荧光 无荧光 50 倍荧光强度 COOHNO 2 I NH 2 OH 12/45

5.1.4 影响荧光光谱的外部因素  入射光强，荧光强度与入射光强成正比  溶剂，一般溶剂效应，折射率和介电常数的影响 特殊溶剂效应，物质分子与溶剂的化学作用 增大溶剂极性，向长波移动，荧光强度增加  温度，升高温度 → 物质粒子碰撞增多 → 减弱荧光  pH 值，荧光物质本身弱碱或弱酸性时影响较大  内滤光，溶液中存在能吸收荧光的物质，减弱荧光  自吸收，溶液浓度较大时，部分荧光会被物质本身吸收 13/45

吸收光谱与荧光强度（激发的选择？） 波长 吸光度 吸收光谱 波长 强度 荧光光谱  吸收强度越大，被激发到高能级的粒子数越多，则向下 跃迁产生的荧光越强 14/45

550nm 15/45

荧光光谱的定量分析： 荧光与吸收光强： 朗伯 - 比尔定律： } 稀溶液近似 16/45

例题 假设某物质的吸收截面为 σ= cm 2 ，用功率为 10mW 、波长为 λ=500nm 的激光激发荧光。如果聚焦体积为 5mm×1mm 2 ，荧光量子效率为 0.5 ，荧光收集 效率为 10% ，用量子效率为 η=25% 的光电倍增管探测，那么可以探测到的最小分 子浓度 N i 是多少？假设光电倍增管的暗电流为每秒 10 个光生电子，信噪比大于 3:1 。 解：要求最小的单位时间内的吸收光强为： I=10*3/0.25/0.1/0.5=2400 ( 个光子 ) 单位时间内激光发射的光强为： I 0 =10/hv=2.5*10 16 ( 个光子 ) 由吸收定律得到： N i =lg[I 0 /(I 0 -I)]/ ( σ*b)=83 ( 个 /cm 3 ) 17/45

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5.2 荧光探测 吸收光谱 荧光光谱 两点区别： 1. 在入射光的垂直方向探测 2. 探测器前还有一个单色器 20/45

 荧光光谱直接测量有两种形式：  激发光谱：固定荧光发射波长，扫描激发波长，与吸收光谱 类似  发射光谱：固定荧光激发波长，扫描发射波长，这才是真正 意义上的荧光光谱  往往有些物质的激发光谱相似，但是发射光谱不同，所以荧 光测量具有更好的特异性 21/45

F-4500 荧光光度计光路图（日立） 22/45

更多的荧光探测技术 (1) 三维荧光光谱  激发波长 + 发射波长 + 荧光强度，完整地描述了物质的 荧光特征  总发光光谱、等高线谱、激发 - 发射矩阵、全扫描荧光 光谱  在每个激发波长下测量荧光光谱 23/45

三维图 等高线图 24/45

（ 2 ）同步荧光光谱技术  在同时扫描激发单色器和发射单色器波长的情况下测量荧光光强，由测得的荧光 强度对发射或激发波长作图  两种同步扫描形式 —— 固定波长和固定能量（波长或能量间隔的选择很重要，选 择恰好等于某吸收带和发射带波长间距）  固定波长：激发波长与发射波长间隔固定（沿三维谱的 45 度方向就可得到固定波 长的同步荧光光谱）  固定能量：激发光波光子能量与发射光波光子能量差固定  特点：① 与激发光谱及发射光谱都有关系，能使选择性进一步改善 ② 能够增强强带而减小弱带的干扰 ③它可以消除瑞利散射信号的干扰，也能够使拉曼强度降低，但同时会把 拉曼吸收峰拉宽 25/45

丁省 (4 个苯环 ) 的 同步荧光光谱 26/45

（ 3 ）激光诱导荧光光谱技术  使用激光代替普通光源激发荧光  具有如下特点：  信噪比更好，灵敏度更高：激光强度大，方向性好（对荧光干扰 小），谱线窄（容易用滤波器滤除）  选择性高：只有与分子能级间隔相匹配的激光才能被吸收而激发出 荧光  适合于微区分析：激光光束可以聚焦成很小的光斑  其它：可调谐激光器可省去激发单色仪 27/45

计算机 电子电路 光电探测器 聚焦透镜 物镜 滤光片 样品 斜射式检测系统 28/45

共聚焦检测系统 针孔和样品上检测点 分别出于光路两个共 轭焦点上，这样检测 点处产生的荧光才能 通过针孔。 可以有效地提高信噪 比！ 计算机 电子电路 光电探测器 二向色镜 聚焦透镜 滤光片 样品 针孔 主物镜 29/45

（ 4 ）时间分辨荧光光谱技术  物质在光激发下，荧光强度会随时间而变化，可测量荧光寿命  如何测量荧光强度随时间的变化？（荧光衰减是个快瞬变过程）  脉冲取样技术，时间相关单光子计数法，相移法 30/45

脉冲激光器 样品池 光电 倍增 管 分光镜 聚光镜 单色器 高速光敏 二极管 取样 积分器 取样触发信号 电源 记录器 脉冲取样积分技术 31/45

时间相关单光子计数 脉冲激光器 样品池 光电 倍增 管 B 分光镜 聚光镜 单色器 光电 倍增管 A 电源 电压甄 别器 A 电压甄 别器 B 可调延 迟装置 时幅 转换器 多道 分析仪 记录仪 启动 停止 32/45

 光电倍增管 A 产生的信号通过电压甄别器 A 产生一系列脉冲信号，脉冲信号将启 动时幅转换器工作，使其产生一个随时间线性增长的电压信号  光电倍增管 B 探测荧光信号，通过电压甄别器 B 产生脉冲信号，脉冲信号将在时间 t 终止时幅转换器工作，并将脉冲存入多通道分析仪中与时间对应的相应通道  要求光电倍增管 B 产生的荧光脉冲只有 1 个 U U=U 0 （ t-t 0 ） t t 激光脉冲 荧光光子 脉冲计数 通道序数 33/45

相移法 激光器 样品池 光电 倍增 管 B 分光镜 聚光镜 单色器 光电 倍增管 A 电源 相位 比较器 记录仪 Ω 泡克尔斯盒 34/45

 以频率 Ω 正弦调制激发光振幅，荧光振幅也将以频率 Ω 变化，但是由于荧光发 射需要时间，它与激发光之间存在相位延迟，该相位延迟与荧光寿命成正比 强度 时间 激发光 荧光 35/45

5.3 荧光光谱的应用 如何利用荧光进行物质分析？ (1) 物质本身具有荧光特性， 芳香族化合物，色氨酸 （ Trp ）、酪氨酸（ Tyr ）和苯丙氨酸（ Phe ） (2) 待测物质与荧光试剂结合后形成能发射荧光的 物质， 无机离子与有机荧光试剂形成能发荧光的络合物 (3) 将待测物质用荧光团（荧光探针）进行标记， 专一而牢固的结合，结合不会破坏物质分子的结构和空间构象 36/45

待测离子荧光试剂吸收波长荧光发射波长 Al 3+ ， Fe - 茜素紫酱 R 470 nm500 nm B 4 O 2 2- 苯偶姻 370 nm450 nm Sn 4+ 黄烷醇 400 nm470 nm Li + 8- 羟基喹啉 370 nm580 nm 常用有机荧光试剂 37/45

一些典型的荧光团 色氨酸 348 nm4‘,6- 二脒基 -2- 苯基吲哚 461 nm 增强型绿色荧光蛋白 509 nm 四甲基罗丹明 576 nm 染料 667 nm 38/45

绿色荧光蛋白（ GFP ） —— 一种广泛应用的活体蛋白 39/45

Matrumi Y, et al. Atmospheric Enviroment, 2005,39: 激光诱导荧光光谱检测大气中的 SO 2 40/45

Ramasubramanian M K, et al. IEEE Sensor Journal, 2005, 5(5): 荧光法在线检测纸中的木质素含量 激发波长 532nm 41/45

Roy A S, et al. Spectrochimica Acta Part A, 2013,102: 荧光光谱研究异黄酮与 BSA 的相互作用 没有异黄酮 存在异黄酮 42/45

利用同步荧光光谱分离色氨酸 1 、酪氨酸 2 和苯丙氨酸 3 的重叠荧光峰 一般荧光光谱 同步荧光光谱 ( 波长差 70nm) 张悦等. 食品科学, 2010,31(16): /45

Xiao Y, et al. Nano Letter, 2011,11: 纳米线荧光的测量 44/45

课堂练习 1 ．氧气在 760 nm 附近的吸收截面约为 cm 2 ，假设在一个光程为 1 m 的气体容 器中充入氧气，测得吸光度为 0.1 ，试问容器中单位体积内有多少个氧气分子？ 2. 化合物 C2H4 与 CH2=CH-CH=CH2 在紫外光谱上有什么差别？为什么？ 3 ．下列化合物中，荧光信号显著的化合物是 ( ) 4 ．荧光分光光度计中激发光方向与探测方向呈 角度，这是因为 。 5 ．荧光光谱的形状与激发波长有关。选择最大激发波长，可以得到最佳荧光信号。 （ ） 6 ．荧光过程中电子能量的转移没有电子自旋的改变；磷光过程中电子能量的转移 伴随电子自旋的改变。（ ） 45/45