从肾小球基底膜断裂的病理环 节发掘肾脏新月体形成早期的 尿生物标志物 黄岩杰 1 ，张书胜 2 ，杨晓青 1 ，毕亮亮 1 ，邓志芬 2 ， 王贝 2 ，吕晶晶 1 ，李静 1 ，梅晓峰 1 ，李金刚 1 1. 河南中医学院第一附属医院儿科实验室 2. 郑州大学化学与分子工程学院 2015 urimarker 北京

汇报提纲 研究背景 研究假设 研究计划 拟解决的关键科学问题 可行性分析

新月体 新月体属病理形态学概念，是指各种原因导致肾小球毛细血管壁严重损伤和 断裂，肾小球鲍曼囊被毛细血管漏出的血细胞、纤维素以及浸润的单核细胞、增 生的上皮细胞填充，在毛细血管球外侧形成的半球状结构（如图 2 和图 3 所示）， 形成的新月体压迫肾小球、导致缺血坏死，最后肾小球硬化废弃，造成患者肾功 能受损。 图 1 正常肾小球 图 2 细胞性新月体 图 3 新月体 模式图 研究背景 1. 新月体形成的性状和百分比是决定多种肾小球疾病病 情轻重、确定治疗方案和判断预后的重要病理因素。

研究背景 2. 新月体形成的性状和百分比也是决定紫癜性肾炎病 情轻重、确定治疗方案和判断预后的重要病理因素。 紫癜性肾炎（ Henoch-Schonlein purpura nephritis, HSPN ）是过敏性紫 癜（ Henoch-Schonlein purpura, HSP ）最严重的并发症，也是影响 HSP 预后的决定因素之一。占小儿继发性肾小球疾病的首位。 国际儿童肾脏病学会将 HSPN 病理分为Ⅰ - Ⅵ级, 其中Ⅲ - Ⅴ级的分级主要是 依据肾小球系膜细胞增生程度和新月体形成的百分比： Ⅲ型 : 新月体 <50% Ⅳ型 : 新月体 50%-75% Ⅴ型 : 新月体 >75% IV- Ⅴ级临床表现重、病情进展快、肾衰发生比例高。 中华医学会儿科学分会肾脏病学组也是依据 HSPN 临床表现和病理分级， 尤其是新月体比例，制订了诊疗指南。

研究背景 3. 发掘简便易行、非创伤性的肾脏新月体形成早期 的尿生物标志物是目前亟待解决的关键科学问题。 目前，新月体病变的发现依赖于肾活检。尿液是探索肾脏疾病无创性 标志物的良好来源，深入解读尿液中包含的信息，能客观、及时地反映肾 脏局部的特定病理变化。 关于尿中新月体形成的标志物的研究， Iwano 等用 ELISA 方法检测到尿 中纤维母细胞特异性蛋白 -1 （ FSP-1) 可以作为新月体形成的生物标记物。 FSP-1 作为上皮 - 间叶细胞转分化（ epithelial mesenchymal transition ， EMT ）的标记难以早期预测新月体的形成， 目前，临床上仍缺乏预示早期新月体形成的尿生物标志物。

研究背景 4. GBM 的严重损伤和断裂是不同病因下新月体形成的共 同病理事件。 图 4. 总结多条途径参与新月 体形成早期肾小球毛细血管 腔内的病理损伤 HSPN 新月体的形成与下列一系列事件有关：① IgA 循环免疫复合物在内皮下和 系膜区沉积。② 局部补体的激活。③ 系膜和内皮细胞产生的 IL-8 诱导嗜中性粒细 胞的浸润。④ 刺激内皮细胞表达 von willebrand factor 和组织因子，启动凝血级 联，导致了肾小球纤维蛋白的沉积。⑤ 基底膜的破坏。⑥ 在包曼囊内巨噬细胞 浸润和细胞因子诱导上皮细胞增生。⑦ 包曼囊完整性的破坏和间质纤维母细胞进 入包曼囊，导致了纤维化的形成。⑧ 肾小球和骨髓起源细胞的遗传学差异，影响 了新月体产生的个体易感性。 本次研究我们将聚焦新月体形成早期 GBM 破坏的病理事件， 在尿中寻找参与这一病理事件的生物标志物，目前在国内 外文献报道中尚未见同类研究。

研究背景 5. 酶可能是 GBM 受损的主要攻击物，而某些重要的炎症因 子和高凝状态参与了酶的激活。因此导致 GBM 的断裂和新 月体的形成。 肾小球毛细血管壁的组成成分包括内皮细胞、 GBM 和足细胞足突。 其中， GBM 由Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白和硫酸肝素蛋白 多糖组成。不像内皮细胞和足细胞， GBM 的组成主要是基质、胶原蛋 白成分，因此， GBM 损伤的主要攻击者是酶。 图 5 肾小球毛细血管壁的组成 肾小球基底膜

研究背景 基质金属蛋白酶（ Matrix metalloproteinases, MMPs) 参与 了细胞外基质的降解，其中 MMP-2 、 MMP-9 属明胶酶，可 降解 GBM 的组分，尤其 MMP-9 是降解 GBM 中 IV 型胶原的 主要酶类物质 。 课题组前期研究： 我们检测到 MMP-9 在 HSPN 肾小球炎性增生的毛细血管袢区、 GBM 断裂处和新月体形成细胞内大量表达 ( 图 6) ； 图 6 MMP-9 在 HSPN 肾小球内的表达

课题组前期研究： 我们同时检测了临床和病理诊断为 HSPN 的患儿尿中 MMP9 、Ⅳ型胶原含量，发现 HSPN 新月体形成患儿 尿中 MMP9 ( 图 7) 、Ⅳ型胶原含量明显高于无新月体 形成患儿 ( 图 8) 。 图 7 各组尿 MMP9 的浓度图 8 各组尿Ⅳ型胶原的浓度

MMP-9 能裂解几乎所有的细胞外基质成分，尤其 是Ⅳ型胶原。所以，理论上 MMP-9 基因敲除后新月 体形成会减少，但是动物实验研究并没有得到预期 的结果，提示在新月体形成过程中除 MMP-9 以外还 存在其它的 GBM 降解酶。 寻找真正参与新月体形成早期 GBM 降解的酶，是 本研究拟解决的关键问题之一。

研究假设 免疫炎症和高凝状态可能协同作用导致肾小球局部 MMPs 表达增加、活化， MMPs 或协同其他酶裂解 GBM ，造成 GBM 严重损伤或断裂、炎症物质和纤维素渗出，刺激上皮细胞增 生形成新月体。 那么，能否在尿中检测到一组导致 GBM 断裂的关键酶和 GBM 组分的裂解产物用来早期诊断新月体形成？

研究计划 1. 鉴于人尿蛋白组学研究，可能存在留尿时间、饮食、药物 和病程长短等因素的影响，以及受人体肾组织取材所限， 难以结合肾脏病理验证和确认标志物的诊断价值。因此， 在高友鹤教授的指导下，本研究计划首先在同质性、可控 性更强的新月体肾炎动物模型中筛选新月体形成早期的尿 生物标志物。 2. 结合病理学和分子生物学技术在 HSPN 患儿的肾组织和尿 标本中对标志物进行定性定量检测，初步验证。

敬请各位专家批评指正！