生物信息学软件及使用技巧

内容概要 一. 生物信息学的概念 二. 生物信息学软件的主要功能简介  分析和处理实验数据和公共数据，加快研究进度，缩 短科研时间  提示、指导、替代实验操作，利用对实验数据的分析 所得的结论设计下一阶段的实验  用计算机管理实验数据  寻找、预测新基因及预测其结构、功能  蛋白高级结构预测

三.生物学软件部分常见功能使用技巧 PCR 引物设计 DNA 、蛋白质序列同源分析及进化树构建 Contig Express----DNA 序列片断拼接 DNA 模拟电泳 重要生物数据库简介 四.生物信息学服务

一. 生物信息学的概念

生物信息学的概念： 生物信息学是一门新兴的 交叉学科，它将数学和计算机 知识应用于生物学，以获取、 加工、存储、分类、检索与分 析生物大分子的信息，从而理 解这些信息的生物学意义。

二. 生物信息学软件的主要功能 简介

生物信息学软件主要功能 1. 分析和处理实验数据和公共数据， 加快研究进度，缩短科研时间 分析和处理实验数据和公共数据， 加快研究进度，缩短科研时间 2. 提示、指导、替代实验操作，利用 对实验数据的分析所得的结论设计 下一阶段的实验 提示、指导、替代实验操作，利用 对实验数据的分析所得的结论设计 下一阶段的实验 3. 实验数据的自动化管理 实验数据的自动化管理 4. 寻找、预测新基因及其结构、功能 寻找、预测新基因及其结构、功能 5. 蛋白质高级结构及功能预测（三维 建模，目前研究的焦点和难点） 蛋白质高级结构及功能预测（三维 建模，目前研究的焦点和难点）

功能 1. 分析和处理实验数据和公共数据， 加快研究进度，缩短科研时间  核酸：序列同源性比较，分子进化树构建， 结构信息分析，包括基元 (Motif) 、酶切点、 重复片断、碱基组成和分布、开放阅读框 （ ORF ），蛋白编码区（ CDS ）及外显子 预测、 RNA 二级结构预测、 DNA 片段的拼 接  蛋白：序列同源性比较，结构信息分析 （包括 Motif ，限制酶切点，内部重复序列 的查找，氨基酸残基组成及其亲水性及疏 水性分析 ) ，等电点及二级结构预测等等  本地序列与公共序列的联接，成果扩大

网上数据库的运用（成果扩大） IRACE ( 基因拉长功能） BLAST 同源序列检索 ENTREZ SYSTEM ( 集成 信息检索系统 )

ENTREZ 集成检索示意图

Vector NTI Suit 同源比较 — 主窗口

Vector NTI Suit 同源比较 — 进化树

Antheprot 5.0 Dot Plot 点阵图

Peptool Lite--- Dot Plot 点阵图

DNASIS 2.5 蛋白二级结构预测

DNASIS 2.5 RNA 二级结构预测

DNASIS 2.5 tRNA 二级结构预测

RNAStructure 3.5 RNA 二结构预测

Omiga 2.0 ORF Map

DnaStar 之 Protean 对氨基酸的亲疏水性 分析： helical wheel 图

功能 2. 提示、指导、替代实验操作，利用对实 验数据的分析所得的结论设计下一阶段的实验 用软件设计 PCR 引物，测序引物 或杂交探针，设计克隆策略，构建 载体，做模拟电泳实验，即模拟核 酸内切酶或内肽酶对相应的底物分 子切割后的电泳行为。蛋白跨膜区 域分析，信号肽潜在断裂点预测。

Vector NTI Suit 5.5 模拟电泳

Gene Construction Kit 2.0 模拟电泳

Winplas 2.6 质粒构建

OLIGO 5.0 PCR 引物设计

Atheprot 5.0 预测蛋白跨膜区域

Antheprot 5.0 预测信号肽断裂点

功能 3. 用计算机管理实验室数据及文献资料 实验室结果的储存，管理和申报工作 从网络数据库获得的序列文件（由 ENTREZ 集成检索系统所得的数据文件可以进入 EndNote 或者 Reference Manager 储存管理） 或资料文献的管理  软件 : EndNote ， Reference Manager

Reference Manager 9 界面

功能 4. 用计算机预测新基因及其结构和功能 对 CDS （ Coding Sequence ）蛋白编码区的预 测准确率已达到 90% 以上 对整个基因结构的预测存在一定难度  PWM （位置权重矩阵）算法 由物化原理技术开发，侧重于找基因表达系 统和核酸相互作用的位点。给信号序列各个 位置每种可能出现的核苷酸分配一个分数， 将各位置分数相加后得出该序列作为潜在作 用位点的分数。

DNASIS 2.5 对蛋白编码区的预测 A. (Codon Bias)

DNASIS 2.5 对蛋白编码区的预测 B. (Rare Codon)

DNASIS 2.5 对蛋白编码区的预测 C. (ORF List)

DNASTAR 之 GeneQuest 预测 CDS

功能 5. 蛋白高级结构预测 该项技术算法十分复杂，尚未成熟。 PDB 及 MMDB 数据库目前仍然禁止收录软件预测出来 的蛋白高级结构模型。 X 射线晶体学技术和多维核磁共振技术是当前 人们认识蛋白高级结构的主要手段，但两种技 术都有不足之处。前者要求必需得到高标准的 蛋白晶体，后者对分子量大于 3 万的大蛋白不 能测定。因此理论模拟和结构预测显得十分重 要。 序列与结构关系的根源在于 “ 蛋白质折叠的问 题 ” ，这是近期研究关注的焦点。

目前应用的蛋白质结构预测的算法 1. 同源预测 ( 一级结构决定高级结构 ) 2. 结构与结构相对比（ DALI 算法） 3. 当前最先进的结构预测方法： 结构类识别（ fold recognition ） 先建立一个已知的结构类数据库（ fold library) ，将待测序列 “ 穿过 ” 该数据库构成的座 标，并根据事先确定的物理限制，逐个位置移 动（ threading ， sequence-structure alignment) ， 并用一个函数（ sequence-structure fitness alignment) 判断序列与结构类的符合程度，找 出未知序列在目标结构上的能量最优和构象最 稳固的比对位置。对计算机要求很高。

Cn3D 2.5 显示 1EQF A 链三维结构

RasMol 2.7 显示 1EQF A 链三维结构

PDB 与 MMDB 结构图比较

三. 生物学软件部分常见功能 使用技巧

PCR 引物设计

引物设计的原则 首先引物要跟模板紧密结合，其次引 物与引物之间不能有稳定的二聚体或发 夹结构存在，最后引物不能在别的非目 的位点引起高效 DNA 聚合反应 ( 即错配 ) 。

围绕这几条基本原则，设计引物需 要考虑诸多因素，如引物长度（ primer length ），产物长度（ product length ）， 序列 Tm 值 (melting temperature) ， ΔG 值 (internal stability) ，引物二聚体及发夹 结构（ duplex formation and hairpin ）， 错误引发位点（ false priming site ），引 物及产物 GC 含量（ composition ），有 时还要对引物进行修饰，如增加限制酶 切点，引进突变等。

引物设计要点 一般引物的长度为 16-23bp ，常用的长度为 bp ，过长或过短都不合适。 引物 3 ’ 端的碱基一般不用 A ，因为 A 在错误引发 位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基 的错误引发效率相对小一些。 引物的 GC 含量一般为 45-55% ，过高或过低都 不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能 相差太大。 引物所对应模板序列的 Tm 值最好在 72 ℃左右， 当然由于模板序列本身的组成决定其 Tm 值可 能偏低或偏高，可根据具体情况灵活运用。

ΔG 值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是 一个重要的引物评价指标，一般情况下，在 Oligo 5.0 软件的 ΔG 值窗口中，引物的 ΔG 值最 好呈正弦曲线形状，即 5 ’ 端和中间部分 ΔG 值较 高，而 3 ’ 端 ΔG 值相对较低，且不要超过 9 （ ΔG 值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正 确引发反应而可防止错误引发。分析其原理， 引物与模板应具有较高的结合能量，这样有利 于引物与模板序列的整合，因此 5 ’ 端与中间段 的 ΔG 值应较高，而 3 ’ 端 ΔG 值影响 DNA 聚合酶 对模板 DNA 的解链，过高则不利于这一步骤。

可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模 板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率 高，错误引发的引发率一般不要高过 100 ，最好 没有错误引发位点，如此可以保证不出非目的 产物的假带。 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过 4.5 ， 否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓 度从而导致 PCR 正常反应不能进行。 对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载 体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物 修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有 利于以后的工作。

关于引物的自动搜索和评价分析 推荐使用自动搜索软件： Primer Premier 5.0 推荐使用引物评价软件： Oligo 5/6 实际操作示例 > > > > >

DNA 、蛋白质序列同源分析及 进化树构建

相似性与同源性 相似性是指一种很直接的数量关系，比 如部分相同或相似的百分比或其它一些 合适的度量。可进行自身局部比较。 如 Dot Plot ( 点阵序列比较 ) 同源性指从一些数据中推断出的两个基 因或蛋白质序列具而共同祖先的结论， 属于质的判断。 如 Alignment ( 同源性分析 )

推荐软件 相似性分析 Peptool Lite 同源性分析 Vector NTI Suit 6---AlignX 实际操作示例 > > > > >

Contig Express----DNA 序列 片断拼接

推荐软件 DNA 序列片断拼接 Vector NTI Suit 6---ContigExpress Project 实际操作示例 > > > > >

DNA 模拟电泳

一点体会 DNA 模拟电泳具有一定实验预示功能， 模拟电泳不能作为实验结果或依据 实际操作示例 > > > > >

重要生物数据库简介

三大数据库 NCBI ( 美国 ) DDBJ ( 日本 ) EBI ( 欧洲 )

其他重要数据库 酵母基因组数据库（ SGD ） 酵母蛋白质数据库（ YPD ） 拟南芥数据库（ AtDB ） 医学数据库（ OMIM ） 线虫数据库（ ACEDB ）

四. 生物信息学服务

服务内容 1. PCR 引物、测序引物及杂交探针的设 计及评价 2. DNA ，蛋白质序列同源分析及进化树 构建 3. 生物大分子二级结构模拟显示及基本 序列分析

4. 有关蛋白质亲疏水性，等电点，抗原性， 跨膜蛋白，信号肽等分析以及 Dot Plot 服务 5. 质粒载体构建及克隆策略 6. 小型数据库建设及协助实验室进行数据 管理维护

7. 医学相关的图像、病例统计、分析及小 型数据库建设 8. 网上数据库应用辅助：包括序列拉长 （扩大实验成果）， Blastn/Blastp ， NCBI Entrez 查询 ( 多维查询 ) ，新序列、 SNIP 等申报 9. 蛋白质三维结构初步预测（此为生物信 息学目前研发的焦点，正在探索中，结 果可能不十分准确或者不能出结果）

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