荧光原位杂交实验 F luorescence In Situ Hybridization

原位杂交 (In situ hybridization) 1 ）同位素原位杂交 (Isotopic in situ hybridization) ——70 年代 2 ）非同位素原位杂交 (Non-isotopic in situ hybridization) ——80 年代中后期 （ 1 ）免疫酶联 （ 2 ）荧光原位杂交（ Fluorescence in situ hybridization, FISH) ** 同位素原位杂交的不足之处： 1 ）不稳定； 2 ）高背景； 3 ）曝光时间长； 4 ）结果统计学处理繁琐。 5 ）同位素的使用和处理

实验的基本原理 : FISH is the detection of highly specific DNA probes which have been hybridized to either interphase or metaphase chromosomes using fluorescence microscopy.

DNA for probe use is labeled with fluorescent (direct method) or non fluorescent molecules which are then detected by fluorescent antibodies (indirect method). The probes bind to a specific region or regions on the target chromosome. The chromosomes are then stained using a contrasting color, and the cells are viewed using a fluorescence microscope.

** 荧光原位杂交的特点： 1 ）快速； 2 ）信号强； 3 ）特异性高； 4 ）多色。 **FISH 有上述优点的原因： 使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统 标记探针的物质：（ 1 ）生物素 (biotin)/ 地高辛 (digoxigenin) —— 半抗原报告分子（间接标记） （ 2 ）荧光物质（直接标记）

FLUORESCENT labeled dUTP HAPTENE labeled dUTP AMCA-6-dUTP CascadeBlue-4-dUTP Fluorescein-12-dUTP Rhodamine-6-dUTP TexasRed-6-dUTP Cy3-6-dUTP Cy5-dUTP Biotin(BIO)-11-dUTP Digoxygenin(DIG)-11- dUTP Dinitrophenyl (DNP)-11- dUTP

染色体复染的物质 : Propidium Iodide (PI) （红色） DAPI （兰色） quinacrine （绿色） chromomycine A3 （绿色）

染色体 “ 原位抑制 ” 杂交（ chromosome in situ suppression, CISS) 克服散在的重复序列造成的杂交背景，提高信号的特异性，在探针 中加入过量的未标记的竞争性 DNA(competitor DNA) ，如 human Cot-1 DNA ，进行杂交前的预复性。探针中的重复序列与加入的竞 争物中的大量重复序列优先复性，而特异性的单拷贝序列因竞争物 中同源序列拷贝数少，绝大部分仍保持单链状态。 **FISH 技术的应用 1 ）基因（或 DNA 片段）的染色体定位； 2 ）染色体数目与结构异常的检测； 3 ）间期细胞遗传学（绒毛 / 羊水 / 精子 / 卵裂球 / 其它间期细胞研究与 诊断）； 4 ）肿瘤遗传学研究

** 用于 FISH 的探针 1 ）单拷贝探针： （ 1 ）种类： YAC ， BAC ， Cosmid ， Plasmid ， cDNA 片段 （ 2 ）应用 （ a ）定位 DNA 片段及嵌合体克隆验证； （ b ）确定染色体微小缺失与重复； （ c ）染色体断裂点分析。 （ d ）间期细胞染色体数目异常诊断。

DNA 片段的染色体定位

FISH 检测微小缺失

染色体片段重复 Dup 19(p

21q22.2 BAC 克隆在 Down 综合征间期细胞中的杂交信号

２）简单重复序列探针 (simple repetitive probes) —— 异染色质着丝粒探针 (heterochromatic centromer probes) 其靶序列为 α 卫星 DNA 或卫星 III DNA(alpha satellite/satellite III DNA) 多位于染色体的着丝粒和异 染色质区域，重复数百次至数千次。 特点：信号强 应用： (a) 标记染色体识别 (b) 染色体数目异常检测 (c) 间期细胞遗传学研究和临床诊断

** 间期细胞遗传学的意义： 细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十 分之一，经细胞培养和相应处理才能获得染色体。 人体的大部分细胞并不进行分裂，很难通过培养 获得中期染色体分裂相，间期 FISH 为这一时期 遗期传物质的研究提供了可能，而且快速。

３）染色体涂染探针 (chromosome painting probes) 整条染色体探针或染色体区带特异性探针 探针来源： （ 1 ）含有人单条染色体的人 - 啮齿类 (human-rodent) 体细胞杂 种组织融合的产物； （ 2 ）荧光激活的流式细胞仪 (fluorescence-activated cell sorter,FACS) 分离整条染色体 DNA ，并以载体克隆 /PCR 扩 增； （ 3 ）显微切割得到染色体或染色体片段， PCR 扩增； 应用 （ 1 ）染色体数目和结构异常分析； （ 2 ）不同物种间的同源性比较； （ 3 ）白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。

多色 FISH （ muti-color FISH) 多色复合染色体 FISH 探针 (multiplex FISH, M-FISH probes) # 两种以上不同的非同位素标记，不同的荧光检测系统， 通过不同的滤光片组合或极少数几种非同位素标记探针 后，按照不同的比例混合，可以显示多种颜色。

实验的基本操作步骤及时间安排 一 淋巴细胞的培养及染色体标本制备 第一天（星期一）采血、接种（ 10:00 ） 第二天（星期二）培养 第三天（星期三）培养 第四天（星期四）上午 7:00 加秋水仙素,( 终浓度 0.2ug/ml ） 至上午 10:00 结束培养 制片，不染色，在显微镜下挑选分散良好的标本。将选好的 标本放入 50 ℃烤片。

第五天（星期五） 探针变性： 75 ℃水浴 5 分钟，立即置于 0 ℃（冰浴中） 5-10 分钟。 玻片标本变性： ℃温箱中 2 小时 2. 标本在 ℃， 70% 甲酰胺 /2XSSC 中变性 2-3 分 钟。 3. 立即脱水， % 顺序，各 5 分钟。 4. 室温干燥

原位杂交： 将变性的 DNA 探针 10ul 滴于变性并脱水的 玻片标本上，盖上盖玻片， Parafilm 封片， 置于湿盒中 37 ℃杂交过夜。（ 15-17hr ） 第五天实验结束

( 第六天，星期六 ) 洗脱、信号放大和免疫荧光检测 1. 用刀片将盖片揭起，轻轻移掉。 ℃ 50% 甲酰胺 /2XSSC 中洗 3 次，每次 5 分钟。 ℃ 1XSSC 中洗 3 次，每次 5 分钟。 4. 室温下， 2XSSC 轻洗一下。 5 加 180ul 封闭液 I ，以薄膜盖片， 37 ℃温育 20 分钟 ，加入 180ul avidin-FITC,37 ℃温育 45 分钟。 6. 取出标本， 45 ℃， 4XSSC/0.1%Tween20 中洗 3 次，每次 5 分钟。

7 加封闭液 II,37 ℃温育 20 分钟。 8 加 180ul antiavidin 于标本上， 37 ℃ 45 分钟。 9 取出标本， 45 ℃， 4XSSC/0.1%Tween20 中 洗 3 次，每次 5 分钟。 10 加 180ul 封闭液 I ， 37 ℃温育 20 分钟。 11 加 180ul avidin-FITC ， 37 ℃温育 45 分钟。 12 取出标本， 45 ℃， 4XSSC/0.1%Tween20 中洗 2 次，每次 5 分钟。再于 2XSSC 室温轻洗一下。

13 将玻片自然干燥， PI/antifade 复染，盖上盖片。 14 镜检、照相。