分子技术在肿瘤靶向药物 治疗的应用 中南大学病理学系 湘雅医院病理科 周建华

肿瘤靶向治疗 （ Target therapy of cancer ） 依据已知肿瘤发生的异常分子和基因， 设计和研发针对这些特定的分子和靶点 药物，选择性杀伤肿瘤细胞的治疗方法； 靶向治疗的前提就是明确肿瘤的特异靶 基因变异类存在与否和变异类型； 个体化治疗的雏形。

荧光原位杂交（ Fluorescence in situ hybridization ， FISH ）技术

简介 FISH = Fluorescence In Situ Hybridization 利用荧光标记的 DNA 探针检测组织或细胞 内与其互补的 DNA 片段 应用：遗传病诊断 血液肿瘤 实体瘤 样本：羊水、绒毛、流产组织、外周血、 骨髓、体液及各种肿瘤组织等

用已知的标记单链核酸为探 针，按照碱基互补的原则， 与待检材料中未知的单链核 酸进行异性结合，形成可被 检测的杂交双链核酸。由于 DNA 分子在染色体上是沿着 染色体纵轴呈线性排列，因 而可以探针直接与染色体进 行杂交从而将特定的基因在 染色体上定位 荧光标 记探针 探针变性 样本 DNA 变性 工作原理

FISH 检测染色体易位（ Translocation ）在 淋巴瘤分型中的应用 FISH 技术在淋巴造血系 统肿瘤中的应用

检测技术特点 不同类型的淋巴瘤染色体易位类型不同 优点 适用于形态学上难以诊断且 IHC 结果不理想的标本； 适用于细胞数量少，形态不典型的活检及穿刺组织。 必须结合组织形态学和免疫组化结果作最后 诊断！！！

FISH 基因检测在淋巴瘤的应用 淋巴瘤 FISH 检测基因临床应用 套细胞淋巴瘤 IGH/CCND1 融合基因辅助诊断 滤泡性淋巴瘤 BCL2/IGH 融合基因辅助诊断、判断预后 弥漫性大 B 细胞淋 巴瘤 BCL6 基因断裂重组辅助诊断、判断预后 伯基特淋巴瘤 C-MYC 基因断裂重组辅助诊断 粘膜相关淋巴组织 淋巴瘤 MALTI 基因断裂辅助诊断 胃粘膜相关淋巴组 织淋巴瘤 API2-MALTI 融合基因指导治疗

弥漫大 B 细胞淋巴瘤（ DLBCL ） 按免疫组化亚型分为 CD5 阳性 DLBCL 生发中心 B 细胞样变型 (GCB) 、 非生发中心 B 细胞样变型 (non-GCB) 3 类 可根据 CD10 、 BCL6 、 MUM1 的表达区分生发中 心 B 细胞样变型、非生发中心 B 细胞样变型。 >30% 瘤细胞表达 CD10 或 CD10(-) 、 BCL-6(+) 、 MUM-1(-) 诊断为 GCB; 其他病例则为 non-GCB 。

◆ BCL6 基因断裂 --- 辅助诊断弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 ◆ BCL6 基因断裂重排 ---- 判断预后 目前研究确定至少 40% 的 DLBCL 涉及 BCL6 基因重排。 一项针对 102 名 DLBCL 患者的 BCL6 重排情况及其与预后关系 的研究显示， BCL6 阳性患者诊断治疗 36 个月后，疾病停止发 展的比率为 82% ，携带有 BCL6 重排的病例预后较好。 BCL6 基因断裂与弥漫性大 B 细胞淋巴瘤

Offit, K. N Engl J Med, (2): p 结果判读

IGH/CCND1 融合基因可见于 95% 的套细 胞淋巴瘤，是套细胞淋巴瘤与其他淋巴瘤 鉴别的重要指标。  IGH/CCND1 融合基因 -- 辅助诊断套细胞淋巴瘤。 IGH/CCND1 融合基因与套细胞淋巴瘤

 正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。  异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两 个融合信号。

API2/MALT1 基因检测试剂盒 探针： GLP API2/GLP MALT1 凋亡抑制因子 2 基因（ apoptosis inhibitor-2,API2 ）, 位于 11 号染色体 ; 粘膜相关淋巴组织基因（ Mucosa-associated lymphoid tissue 1,MALT1 ）， 位于 18 号染色体。 API2 基因与 MALT1 基因的融合导致凋亡抑制的增加， 引起细胞不依赖于抗原刺激的生存优势。

 API2/MALT1 融合基因的检测可以指导抗 HP 治疗 胃 MALT 淋巴瘤与幽门螺旋杆菌（ HP ）感染导 致的慢性胃炎有关， MALT1/API2 融合基因阴性的 患者抗 HP 治疗有效，阳性患者抗 HP 治疗无效。 API2/MALT1 融合基因检测意义

 正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。  异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两 个融合信号。

BCL2/IGH 重排发生在约 80%-85% 的 FL 患者中，检 测 BCL2/IGH 基因重排可以辅助诊断 FL 。 BCL2/IGH 阴性的 FL 患者 3 年生存率为 100% ，而 阳性者只有 54% ； 阴性者 3 年疾病无进展为 87.5% ， 而阳性者只有 13% 。 BCL2/IGH 融合基因与滤泡性淋巴瘤 BCL2/IGH 融合基因 辅助诊断滤泡性淋巴瘤 BCL2/IGH 融合基因 判断预后

 正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。  异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两 个融合信号。

结果判读 - 阳性结果

约 80% 的伯基特淋巴瘤病例发生 t(8 ； 14) （ q24;q32 ）； 约 15% 的伯基特淋巴瘤病例发生 t(2 ； 8)(p11;q24) ； 约 5% 发生 t(8 ； 22) （ q24;q11 ）。 染色体易位导致 C-MYC 基因断裂重组可能是伯基特淋 巴瘤的一个标志，可以应用于临床上伯基特淋巴瘤的辅 助诊断。 C-MYC 基因断裂与伯基特淋巴瘤  辅助诊断伯基特淋巴瘤

结果判读 - 阳性结果

FISH 技术在乳腺癌靶向治疗应用

乳腺癌 Her- 2 基因 致癌基因： Her-2 基因； 位点： 17q11.2-q12 ； 编码蛋白：跨膜蛋白（与 表皮生长因子受体部分同源）； 25-30% 乳腺癌病人都有 HER-2 的扩 增； HER-2 基因扩增是决定 Herceptin 治 疗是否有效的关键性指标。 HER2 扩增的乳腺癌更具有侵袭性生 长能力。

乳腺癌 Her- 2 基因及蛋白检测 Cerb-B-2 :3+ 完全强膜阳性细胞 >30% 2+,1 +,- FISH 检测是否有基因扩增

Her2 基因 检测流程 石蜡组织标本 IHC 检测 再用 FISH 方法检测 — —+ Herceptin 治疗 + 再用 FISH 方法检测 Herceptin 治疗 FISH 检测 + — 再用 FISH 方法检测 +

A. 无须计数的大簇团信 号（高度扩增） B. 颗粒状信号（ R>10 ，高度扩增） C. 须计数的颗粒状信 号（ R=3.5 ，低度扩增） A C B Her-2 基因扩增状况

>30% 的肿瘤细 胞全部的细胞膜 高强度着色 免疫组化（ 3+ ）与 FISH 对比 ×40 ×100 浸润性导管癌Ⅱ级 IHC ： +++ FISH ：呈簇团状高度扩增 ×100

免疫组化（－）与 FISH 扩增阳性 浸润性导管癌Ⅱ级 IHC ：－ FISH ：呈簇状扩增 肿瘤细胞不着色 ×40 ×100

基因突变检测方法

1.RNA 酶 A 切割 (RnaseAcleavage) 2. 变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 3. 杂合双链分析法 (HA) 4. 化学切割错配 (CCM) 5. 碳化二亚胺检测 (Carbodiimide,CDI) 6. 酶促切割错配 (Enzyme Mismatch Cleavage, EMC) 7. 单链构象多态性 (Single-Strand Conformation) 8. 切割片段长度多态性 9.DNA 测序 (Sequencing) 10. 双脱氧指纹图谱法 (Dideoxy Finger-printing, ddF) 11. 错配接合蛋白检测 12. 蛋白截短测试（ protein truncation test ） 方法

13. 变性的高效液相色谱检测 (Denaturing High Performance Liguld Chromatography DHPLC) 14.DNA 芯片技术 (DNAchip) 15. 等位基因特异性扩增 16. 等位基因特异性寡核苷酸片段分析 (Allele- Specific Oligonucleotide,ASO) 17. 引物延伸检测 (Primer Extension,PEX) 18. 寡核苷酸连接检测 (Oligonucleotide Ligation Assay,OLA) 19. 限制性片段分析 (Restriction Fragment Analysis ） 20. 突变体富集 PCR 法（ mutant-enriched PCR ） 21. 蝎形探针扩增阻滞突变系统（ Scorpions amplification refractory mutation system ）

肺癌组织 EGFR 基因扩增和 突变检测及其临床意义

研究背景 研究显示吉非替尼对部分晚期 NSCLC 患者的治疗 效果非常显著。 存在 EGFR 基因突变的患者更有可能对吉非替尼的 治疗敏感。 存在 EGFR 基因扩增的肺癌、肠癌病人对分子靶点 药物更为敏感。 检测大肠癌有无 EGFR 过度表达，只要 >1% 的癌 细胞的胞膜强阳性染色即判断为 3+ ，可作为应用 西妥昔单抗的指征。

FISH 检测 EGFR 基因扩增 标本类型：石蜡包埋组织（手术、活检、穿刺） 冰冻组织 胸、腹水沉渣细胞 探针类型： GLP EGFR / CSP7 定量 PCR 检测 EGFR 基因突变分型 突变类型： 19 exon （ 位点） 15bp 缺失突变 19 exon （ 位点） 18bp 缺失突变 19 exon （ 位点） 12bp 缺失突变 21 exon 2573 位点 T>G 碱基置换突变 21 exon 2582 位点 T>G 碱基置换突变 EGFR 基因变异检测

双体性 三体性 多体性扩 增扩 增 肺癌石蜡肺癌石蜡

FQ-PCR 分型技术检测 EGFR 突变

存在 EGFR 突变肺癌样本的琼脂糖凝胶电泳图 71 例肺癌组织中检测出 6 例突变样本

FQ-PCR 检测 15bp 缺失阳性病例结果 红色阈值线以上的扩增曲线即为 阳性标本的扩增曲线，按荧光信 号值的高低依次为 9 号、 12 号、 13 号、 55 号、 38 号和 33 号标本

15bp 缺失突变型 DNA 的测序图 sense antisense

红色阈值线以上的扩增曲线即 为阳性标本的扩增曲线，按荧 光信号值的高低依次为 2 号、 36 号、和 40 号标本 FQ-PCR 检测 18bp 缺失阳性病例结果

目前 K-RAS 突变检测常用技术

方法 直接测序 焦磷酸测序 高分辨率熔解曲线 PCR-RFLP 芯片 杂交 Real-Time PCR

肿瘤组织的确认和筛选 显微切割肿瘤 提取 DNA 相应的 PCR 反应或杂交 相关的分析和检测 K-ras 突变检测基本流程图

直接测序 (Direct Sequencing) PCR 扩增后产物直接测序 双脱氧核苷酸链终止法 (Sanger 法 ) DNA 片段是荧光标记的，这些片 段经过平板胶电泳或毛细管电泳 得到分离，荧光分子被激发而发 光，发出的光信号被检测系统检 测

K-ras 突变检测结果

疗效预测标志物与预后判断标志物 疗效预测标志物： 能够预测某种特定治疗方式疗效的标记物 KRAS 基因突变导致肿瘤对 EGFR 抑制剂抵抗 预后判断标志物： 在不考虑治疗因素的情况下能够判断患者结局的标 记物 18 号染色体长臂（ 18q ）缺失 某些分子标志物兼具两种作用 胸腺嘧啶合成酶（ Thymidylate synthase ）

EGFR 作为预后因子的价值 EGFR expression correlates with poor prognosis DFS = Disease-free survival; OS = overall survival Tumor typePrognosisSurvival Risk of metastasi s References Colorectal Poor - Decreased OS Increased - Hemming (1992) Mayer, De Jong (1992) Head & Neck (SCCHN) Poor Decreased DFS Decreased OS ---- Grandis (1998) Maurizi (1996) Lung (NSCLC) Poor Decreased OS - - Increa sed Ohsaki (2000) Pavelic (1993)

Cetuxamab( 西妥昔单抗 ) 人源化嵌合单抗（ IgG1 ） 靶向作用于表皮生长因子受体（ EGFR ） 阻断 EGF 和 TGFα 与 EGFR 的结合，抑制酪氨酸激酶活性和其后 的肿瘤生长 200 ４年获得 FDA 审批资格治疗结直肠癌 Panitumumab （帕尼单抗） 完全人源化单克隆抗体 (IgG2) 靶向作用于表皮生长因子受体（ EGFR ） 2005 年 7 月获得 FDA 快速通道审批资格治疗结直肠癌 结直肠癌分子靶向治疗药物

KRAS 突变 KRAS 突变可不依赖 EGFR 受体途径，自行激活 RAS/MAPK 通路 导致 ERBITUX 耐药 KRAS 突变与 Erbitux 疗效及患者生存相关 KRAS 突变并非孤立事件 KRAS 突变常伴随 BRAF 突变，并与 CpG 岛甲基化表型 (CIMP) 1,2 相关 KRAS 突变常伴随 PI3K 突变 3 Lièvre A, et al. J Clin Oncol 2008;26:374–379 MAPK = mitogen-activated protein kinase

K -ras 基因野生型患者能从这类药物治疗中获益。 K-ras 基因突变型患者并不能从抗 EGFR 治疗中获益, 反 而徒增不良反应危险和治疗费用； 抗 EGFR 治疗和 K-ras 突变相互排斥 K-ras 基因抗 EGFR 治疗关系密切

2009 年 7 月 FDA 批准了对西妥昔单抗和帕尼 单抗说明书标签的修改： 结直肠癌分子靶向治疗药物 注明 KRAS 基因突变的结直肠癌患者不推荐这 使用这两种用药物。

K-ras 基因突变 : 20-60% 结直肠癌 K-ras 基因突变发生在肿瘤恶变的早期，原 发灶和转移灶的 K-ras 基因高度保持一致 K-ras 基因突变

 NCCN 临床实践指南指南明确指出所有转移性结直肠癌患者 都应检测 K-ras 基因状态。  美国美国临床肿瘤学会 (ASCO) 推荐把 K-ras 基因突变检测作为 结直肠癌患者接受 EGFR 单抗治疗的预测指标。  欧盟药品审评管理局规定： cetuximab 及 panitumumab 用于 mCRC 的治疗前，患者必须确定为 K-ras 野生型。 K-ras 与结直肠癌治疗

结直肠癌（ CRC ）缺乏 EGFR 基因 突变 对爱必妥单药治疗转移性结直肠癌 （ mCRC ）临床试验中 110 例活检标本 进行的研究未发现 EGFR 基因突变（外 显子 18 － 21 ） Khambata-Ford S, et al. J Clin Oncol 2007;25:3230–3237

抗 EGFR 治疗前检测 KRAS 基因突变 的理由 1. 避免不必要的不良反应 2. 控制不必要的费用 3. 确认能够从治疗中获益的野生型患者 4. 避免治疗对突变型患者的潜在毒性 CHMP gave a positive opinion for ERBITUX May 29, 2008 — but for patients with wild-type KRAS tumors

810 名胃癌病人有 HER2 基因的扩增，约占参与实验总人 数的 22% ； 晚期胃癌接受标准化疗联合 Herceptin 治疗的患者：平均 生存期由 11.1 个月延长到 13.8 个月； 高倍扩增者甚至可达 16 个月； 将死亡风险降低 26% 。 HER2 与胃癌分子靶向治疗

美国临床肿瘤学会 ASCO 提出：  Herceptin 可成为 HER2 阳性晚期胃癌患者的 治疗选择。  晚期胃癌患者在确诊时都应接受 HER2 检测；

HER 基因与胃癌预 后 HER2 基因扩增的晚期胃癌患者往往预后不 佳。 无 HER2 基因扩增的晚期胃癌患者中位生存期 12.6 个月，而有基因扩增者中位生存期仅 5.5 个 月。 存在 HER2 基因扩增的胃癌患者术后 5 年生存率 为 21.4% ，而无扩增的则为 63.0% 。