实验一 血清蛋白质 醋酸纤维素薄膜电泳
一、实验目的 1. 了解电泳的基本原理； 2. 掌握电泳分离蛋白质的原理； 3. 掌握醋酸纤维素薄膜电泳的方法。
二、实验原理 1. 电泳的基本原理 电泳 —— 是带电质点在电场力作用下发生定向 移动的现象。 电泳技术 —— 是利用电泳现象进行物质分离、 纯化及鉴定的技术。
电泳速度的方向： 电泳速度的大小： V =V = QEQE 6πR6πR ∝ Q R – 正极正极 负极负极 F´F´F F = F´ 电场力 F=QE 摩擦力 F´= 6π RV QE= 6π RV
2. 电泳分离蛋白质的原理 蛋白质的两性电离和等电点： 等电点 —— 即 pI ( isoelectric point ), 指氨基酸向两 个方向电离速度相等时的 pH 值。 COOH NH 3 + Pro COO – NH 3 + Pro COO – NH 2 Pro pH pH pI 碱性电离 酸性电离
当 pH=PI 时，所带电荷为 0 ，粒子是静止的； 当 pH>PI 时，进行酸性电离，释放氢离子，带负电， 运动方向是从负极向正极移动； 当 pH<PI 时，进行碱性电离，结合氢离子，带正电， 运动方向是从正极向负极移动； 当 pH 距离 PI 越远时，所带电量越多。 血清蛋白质的等电点为 4.8 ～ 7.5 ，均低于 8.6 ，因 此电泳时常采用 pH8.6 的缓冲液。此时，蛋白质解 离带负电荷，在电场中向正极移动。
3. 醋纤膜分离血清蛋白质的原理 醋酸纤维素薄膜电泳是采用醋酸纤维素薄膜作支持 物的一种电泳技术。 醋酸纤维素薄膜是纤维素的羟基乙酰化形成的纤维 素醋酸酯，具有均一的泡沫状结构，渗透性强，对 分子移动阻力小，用它做区带电泳的支持物，用样 量少，分离清晰，对染料无吸附作用，应用范围广， 快速简便, 且染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液 浸泡透明，透明后的薄膜便于保存和定量分析，因 此目前被广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、 糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。
醋纤膜分离血清蛋白质的方法 以醋酸纤维素薄膜作为支持介质，于薄膜一端加微 量血清，膜两端连接于缓冲液。电泳分离后再经染 色处理，可将血清蛋白质分成五条主要的区带，从 正极依次为清蛋白（ Albumin) 、 α1- 球蛋白、 α2- 球 蛋白、 β- 球蛋白、 γ- 球蛋白。由于染料与蛋白质的 结合是与蛋白质的量成正比，可将各条带分别溶于 碱性溶液再进行比色测定，或用一定的有机溶剂是 薄膜透明化后直接用光密度扫描，从而计算出血清 蛋白质的含量。
三、主要试剂与器材： 试剂：血清 巴比妥缓冲液 染色液，漂洗液 器材：电泳仪，电泳槽 醋酸纤维素薄膜（ 2×8cm ） 血清加样器
四、操作步骤： 1. 浸膜：将裁好的醋酸纤维素薄膜浸泡于缓冲液中， 充分浸透后用镊子取出（约 20min ，直到膜上没有 斑点，中间没有气泡为止）。 2. 点样：毛面向上，用点样器，在距膜一端约 1.5cm 处，点加 3~5μL 待分离血清。注意取样适量、均匀； 血清线位置适当，粗细均匀，不能有明显扩散现象。 1.5cm
3. 搭桥：首先将双层滤纸铺好，分别放置于电泳槽两 端，其下端要浸入缓冲液中。然后，将点好样的薄 膜光面向上平直地贴于电泳槽的支架上。注意桥的 方向，点样的一端位于负极，点样线不能搭在滤纸 上。 醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图
4. 电泳：红正黑负。 电流 2mA/cm 膜宽。 电泳时间约 40 ～ 50min 。 5. 染色：氨基黑 10B, 染色 1-2min. 6. 脱色： 2 个漂洗缸，装入漂洗液，依次漂去多 余染料，直到背景漂白为止。
五、结果与分析： 1. 定性观察：染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。 2. 定量测定：光密度仪扫描法，洗脱比色法
六、临床意义 根据电泳图谱，分析每条色带的前后位置、染色深浅及区带 宽窄等，可以判定血清蛋白质有无种类及含量的变化，进而 帮助诊断疾病。血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳在临床上常用 于分析血、尿等样品中的蛋白质，供临床上诊断肝、肾等疾 病参考。 1 、 M 蛋白（异常免疫球蛋白）血症：在 β- 球蛋白区、 γ- 球蛋白区或两者之 间，出现区带细而浓，有时呈波浪状，在光密度计扫描图上呈尖陡高峰 的 M 蛋白带。 2 、蛋白质缺乏症 3 、肾病 4 、急慢性炎症 5 、肝病：肝硬化出现 “β-γ 桥 ” 原发性肝癌在 Alb 与 α1- 球蛋白之间出现一小的区带，称为甲胎蛋白带
几种疾病的蛋白电泳变化
七、注意事项： 1. 点样时, 毛面向上, 要求样线粗细均匀，无明显 扩散现象。 2. 搭桥时, 光面向上, 点样端置于负极, 样线不能 接触滤纸。 3. 正确连接导线 ( 红色 — 正极，黑色 — 负极）。 4. 电泳过程中，严禁再取放薄膜。