第七章 花药和花粉培养

【学习目的要求】 1. 掌握花药培养和花粉培养的区别 2. 了解花药最佳接种时期 3. 掌握花药培养的大致过程 4. 掌握花粉培养的大致过程 5. 掌握雄核发育的四种途径

第一节 概述 一．花粉培养和花药培养的概念：都指离体培 养花药和花粉，使小孢子改变原有的配子 体发育途径，转向孢子体发育途径，形成 花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植 株，并从中鉴定出单倍体植株并使之二倍 化的技术。

二. 花粉培养和花药培养的区别  花药培养其外植体是植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法 和技术来讲，属于器官培养的范畴。  花粉培养的精确定义是：将处于一定发育阶段的花粉从花药中 分离出来，再加以离体培养。有时花粉培养也称为小孢子培养 (microspore culture) 。从培养方法和技术方面来讲，它属于细 胞培养的范畴。

三．单倍体植物的特点  所谓单倍体 (haploid) 是指具有配子体染色体数的孢子体 ( 植物个体 ) 。 diploid 植物其 haploid 即为 monoploid 玉米 2n = 2x = 20 n = x = 10 水稻 2n = 2x = 24 n = x = 12 柑橘 2n = 2x = 18 n = x = 9 tetraploid 植物其 haploid 为 dihaploid 马铃薯 2n = 4x = 48 n = 2x = 24 陆地棉 2n = 4x = 52 n = 2x = 26 hexaploid 植物其 haploid 为 triploid 普通小麦 2n = 6x = 42 n = 3x = 21 octoploid 植物其 haploid 为 tetraploid 草莓 2n = 8x = 56 n = 4x = 28 单倍体植物与它们的二倍体相比 较，有三个明显的特点： 1. 体细胞染色体数减半； 2. 生长发育弱，体形小、各器官 明显减小； 3. 雌雄配子严重败育，有的甚至 不能进入有性世代。

四. 单倍体的应用潜力 1. 迅速获得纯合型材料，缩短育种年限； 2. 获得育种中间材料； 3. 突变体选育； 4. 体细胞融合； 5. 作为遗传工程受体更为有效 6. 是研究减数分裂，花粉生长机制的生理、生化、遗 传等基础理论的最好方法。

第二节 花药与花粉培养技术 一. 花药培养  花药培养是指改变花粉的发育程序，使其分裂形 成细胞团，进而分化成胚状体，产生再生植株， 或形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株。  目前已有 250 多种植物花药培养成功。花药培养 获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作 物、十字花科作物的育种中广泛应用。

花药培养的基本程序： 外植体选择 —— 外植体 ( 花蕾 ) 预处理 —— 外植体消毒 —— 剥取花药 —— 接种 —— 诱导 培养 —— 分化培养 —— 移栽

1. 花药的材料选择  基因型、生理状态及小孢子发育时期等对花药和花 粉培养效果具有极大的影响，因而是材料选择所要 考虑的主要因素。 (1) 基因型 供体植株遗传背景对花药和花粉培养成败至关重 要。在进行花药和花粉培养时，应选择那些容易培 养成功的材料来做。

品种接种花药数产生胚状体数诱导率（ % ） 元帅 赤阳 国光 金冠 不同苹果品种的花药培养胚状体的诱导率

(2) 生理状态的选择  花药和花粉供体植株的生理状态，对花粉愈 伤组织的诱导率也有直接的影响。不同季节 接种的花药愈伤组织诱导率也有显著变化。 如小麦早期接种的材料比晚期接种的材料愈 伤组织诱导率可提高 2—3 倍。

(3) 花粉发育时期的选择  一般情况下，对大多数植物来说，在单核时 期的花粉比较容易培养成功。确定花粉发育 时期的方法可用涂片法来进行。  PMC→ 四分孢子 → 小孢子单核期 → 小孢子双 核期 → 小孢子三核期（成熟花粉）

表皮 药室内壁 中层 绒毡层 花丝 花粉粒 药隔维管束 百合幼嫩花药结构图

百合成熟花药结构图 药隔 花丝 唇细胞 花粉粒 中层 药室内壁 表皮

 一般选择单核期 细胞核较大居中，称单核中央期。随着细胞体 积迅速增大，细胞核由中央位置推向一边，即单核靠边期。以上 均为单核期花粉。  单核期的确定 根据细胞观察推测，双核期的花粉中开始积累 淀粉，不能使花粉发育成植株。通常采用醋酸洋红或碘化钾染 色，再压片镜检，以确定花粉的发育时期。但是接种前不可能把 所有的花粉都进行一次发育时期的镜检，通常是按照花蕾长度 大小与花粉发育年龄的相关性，在实际操作中取一定大小的花 蕾进行的。如马铃薯在花冠露出萼片一半时大多数花粉处于单核 晚期。

烟草小孢子发育时期对胚状体诱导率的影响 小孢子发育时期培养花药数胚状体（ % ） 单核早期 单核中期 单核晚期 双核早 双核晚

适宜小孢子发育时期代表植物 减数分裂期 四分孢子期 单核早期 单核晚期 单核早期至晚期 单核早期至双核期 四分孢子期至双核期 番茄、草莓 葡萄 油菜、苹果、石刁柏 小麦、茄子、青椒、荔枝、楸子 烟草、柑橘、橡胶、龙眼、杨树 水稻、甘蓝、梨 玉米 一些植物花药和花粉培养适宜的小孢子发育时期

二. 预处理  花药和花粉的预处理措施主要是低温处理。在很多情况 下，低温处理可明显提高花药和花粉培养的效果。  一般耐寒植物比喜温植物可耐受较低的温度，处理的温 度可低些。低温处理时间视使用的温度而定，较低的温 度处理时间要短，较高的温度处理时间宜长。

低温处理的作用： 1. 可以激发花粉母细胞产生两个相等核； 2. 保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞 组织的衰老； 3. 激发花粉产生原胚； 4. 促进细胞同步分裂

 一般情况下，花药和花粉培养所取材料是未开放的花 蕾，其内部的花药和花粉实际上处于无菌状态，表面 灭菌在能杀灭花蕾表面微生物的前提下，处理的强度 以尽可能轻为好。  采集未开的花蕾 → 置于 70% 酒精中浸数秒 → 再置于 0.1% 升汞浸 3 － 5 分钟 → 剖开花蕾，取出花药（去掉花 丝） → 接种在诱愈培养基上（每瓶 3 － 5 个花药）。 三. 外植体制备及接种

花药和花粉培养的方法主要有液体培养、双层培养、分步 培养、看护培养、微室培养等。 所选用的培养基中，花药培养常用的基本培养基： MS （ Murashigc & Skoog ， 1962 ）； Nitsch(Nitsch ， 1969) ； N6( 朱至清， 1974) ； B5(Gamborg et al. ， 1976) 。 四. 培养方法及培养基的选择

花药和花粉培养的主要目的是制备单倍体植株， 但其再生植株并不都是单倍体。因此，必须多获 得的花药和花粉植株进行倍性鉴定。由于单倍体 植株只有配子染色体组成，生活力很弱，难以长 期存活，因此，对鉴定的单倍体植株应尽早进行 染色体加倍处理。 五. 单倍体植株的鉴定和染色体加倍

 鉴定花药和花粉植株染色体倍性的方法有：形态鉴定、结 实性鉴定、染色体数目鉴定和遗传标记鉴定。  花药和花粉有自然加倍的可能，但是发生的频率很低，因 此，一般需对鉴定出的花药和花粉单倍体植株进行人工加 倍。常用的方法是利用 0.02%—0.4% 的秋水仙素处理花药 和花粉单倍体植株，处理方式和部位随植物种类而异。

正常加倍小孢子植株的花序

部分加倍的小孢子植株花序

未加倍小孢子植株的花序

不同加倍情况的花朵形态 — 对照 2 — 正常加倍化 3 、 4 — 部分加倍花 5 — 未加倍按花

二. 花粉培养 花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植 体进行离体培养的技术。由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组 织或胚状体发育成的植株都是单倍体植株，且不受花药的药隔、药 壁、花丝等体细胞的干扰。但缺点是较比花粉培养难度大。 1 、取材时期的确定 花粉和小孢子培养的取材适宜期大多为花粉发育处于四分体到单 核早期的材料。

2. 花粉的分离 (1) 挤压法：未开的花蕾 → 用流水冲洗 10min → 用 75% 酒精浸 10 － 15min → 无菌水冲洗 2 次 → 用 10 漂白粉溶液浸 20min → 用无菌水冲洗 3 次 → 将花药 放在盛有液体培养基的小烧杯中 → 用镊子挤压花药， 散发出花粉粒 → 过滤，滤液低速离心 → 滤液再过滤 一次（每 ml 含 1000 － 个花粉粒即可）。

(2) 漂浮法（自然散落法） 将花药接种于液体培养基中，培养一定天数 后，花药开裂，释放出花粉粒，收集，离心清洗， 重悬。 (3) 机械分离法

3. 培养方法 (1) 直接培养 从未经任何预培养或预处理的新鲜花药中 分离花粉粒，直接接种到合成培养基中进行培 养的方法。

(2) 预培养 将花药在液体培养基中先漂浮培养 2-4d ， 然后挤出花粉，经离心洗涤纯化后悬浮于液体 培养基中进行培养，密度为 个 /ml 。

(3) 看护培养

(4) 条件培养 在人工合成的培养基中加入失活的花药提 取物，然后接入花粉进行培养。由于失活的花 药提取物中含有促进花粉发育的物质，有利于 花粉培养成功。添加花药提取物的浓度因植物 种类而异。

(5) 微室培养 将花粉粒接种在由盖玻片或载玻片制作的 一个微室环境中进行培养。 (6) 双层培养 先在培养皿中铺上固体培养基，凝固后在 其上接种花粉悬浮液。

油菜游离小孢子培养分化成胚的过程

油菜游离小孢子分化形成的胚状体

油菜小孢子培养形成的子叶型胚状体

小孢子子叶型胚状体再生成植株

第三节 雄核发育 一. 雄核 发育的 途径

1. 营养细胞发育途径 单核花粉粒经一次分裂，产生一个营养细胞 和一个生殖细胞。生殖细胞分裂 1 － 2 次就退化 了，由营养细胞分裂增生形成愈伤组织或胚状 体，进而分化为再生植株。 2. 生殖细胞发育途径

3. 营养细胞与生殖细胞共同发育途径 营养细胞与生殖细胞各自脱分化、分裂增生形 成愈伤组织或胚状体的一部分。 4. 花粉粒均等分裂发育途径 花粉粒均等分裂形成两个同样的细胞，各自脱 分化，分裂增生形成愈伤组织或胚状体的一部分。

二. 影响雄核发育的因素 1. 植物的基因型 2. 植物的生理状态 3. 花粉发育时期 4. 预处理：冷处理 / 热处理 / 化学处理 / 其它方法 5. 培养基成分：无机盐 / 碳源 / 激素 / 有及附加物 6. 活性炭 7. 花药壁因子 8. 温度和光照

【本章小结】 1. 花药培养是器官培养，花粉培养属细胞培养，但二者培养目 的是一样， 都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。 2. 花药培养一般选择花粉的单核期进行接种，因为这一时期尚没有淀粉的 积累。 3. 花药培养包括选择材料 — 消毒 — 接种培养 — 愈合组织生成 — 分化出单倍 体植株。 4. 花粉的发育途径包括营养细胞发育、生殖细胞发育、营养和生殖细胞同 时发育及花粉均等分裂发育途径。 5. 花粉培养包括花粉的分离 — 預处理 — 培养过程。

【思考题】 1. 花药培养和花粉培养有何区别？ 2. 花药培养时选择什么发育时期的花药？为什么？ 3. 花药培养时培养基配制有什么特点？ 4. 花粉培养时怎样使用微室培养和看护培养？