蛋白质与人类健康 曹春阳 中国科学院上海有机化学研究所 —— 生命有机化学应用

报告内容 蛋白质分子结构 蛋白质样品制备 蛋白质结构测定

蛋白质 (protein) 是由许多氨基酸 (amino acids) 通过肽键 (peptide bond) 相连形成的高分子含氮化合物。

蛋白质是生物体重要组成成分 分布广：所有器官、组织都含有蛋白质； 细胞的各个部分都含有蛋白质。 含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分 子，占人体干重的 45 ％，某些组织含量更高， 例如脾、肺及横纹肌等高达 80 ％。

蛋白质是生命活动主要载体和功能执行者 免疫防卫 病毒感染 细胞生长 信号转导 药理过程与药物设计 酶催化机制 蛋白质的功能与其三维结构密切相关

组成蛋白质的元素 主要有 C 、 H 、 O 、 N 和 S 。 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、 锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。

氨基酸是蛋白质组成基本单位 存在自然界中的氨基酸有 300 余种， 但组成人体蛋白质的氨基酸仅有 20 种， 且均属 L- 氨基酸（甘氨酸除外）。

H 甘氨酸 CH 3 丙氨酸 L- 氨基酸的通式 R

依据侧链性质氨基酸分四类 非极性疏水性氨基酸 极性中性氨基酸 酸性氨基酸 碱性氨基酸

甘氨酸 glycine Gly G 5.97 丙氨酸 alanine Ala A 6.00 缬氨酸 valine Val V 5.96 亮氨酸 leucine Leu L 5.98 异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02 苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48 脯氨酸 proline Pro P 非极性疏水性氨基酸

色氨酸 tryptophan Try W 5.89 丝氨酸 serine Ser S 5.68 酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66 半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07 蛋氨酸 methionine Met M 5.74 天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41 谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65 苏氨酸 threonine Thr T 极性中性氨基酸

天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97 谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22 赖氨酸 lysine Lys K 9.74 精氨酸 arginine Arg R 组氨酸 histidine His H 酸性氨基酸 4. 碱性氨基酸

半胱氨酸是蛋白质发生多聚原因之一 + 二硫键 -HH-HH 半胱氨酸 分子间发生该反应导致蛋白质聚集； 分子内发生该反应会导致蛋白质构象发生变化；

紫外吸收用于测定蛋白质浓度  大多数蛋白质含有色氨酸、 酪氨酸，它们最大吸收峰在 A=280nm 附近。所以测定蛋 白质溶液 280nm 的光吸收值 是分析溶液中蛋白质含量的 快速简便的方法。 芳香族氨基酸的紫外吸收 A 280 =ε*c*L

一级结构 (primary structure) 二级结构 (secondary structure) 三级结构 (tertiary structure) 四级结构 (quaternary structure) 高级结构 ( 蛋白质构象 ) 蛋白质分子结构

多肽链是蛋白质分子的结构基础 * 肽键 ( peptide bond ) 是由一个氨基酸的  - 羧 基与另一个氨基酸的  - 氨基脱水缩合而 形成的化学键。 氨基酸通过肽键相互连接构成多肽链

+ -HOH 甘氨酰甘氨酸 肽键

多肽链有两端 : N 末端与 C 末端 N 末端 C 末端 二硫键二硫键 牛核糖核酸酶

蛋白质的一级结构 定义：蛋白质的一级结构指多肽链中 氨基酸排列顺序。 主要的化学键 肽键，有些蛋白质还包括二硫键。

一级结构是蛋白质空间构象和特异 性生物学功能的基础

一级结构发生变异会导致 “ 分子病 ” N-val · his · leu · thr · pro · glu · glu · · · · ·C(146) HbS β 肽链 HbA β 肽 链 N-val · his · leu · thr · pro · val · glu · · · · ·C(146) 血红蛋白 HbA 序列变化导致镰刀形红细胞贫血

蛋白质的二级结构  定义 : 蛋白质分子中某一段肽链的局部空间 规律性排列，即该段肽链主链骨架原子的 相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链 的构象 。  主要的化学键： 氢键

蛋白质二级结构主要表现形式  - 螺旋 (  -helix )  - 折叠 (  - sheet )  - 转角 (  -turn ) 无规卷曲 ( random coil )

 - 螺旋 (  -helix )

 - 折叠（  -sheet)

 - 转角和无规卷曲  - 转角 (  -turn) 无规卷曲 (random coil) 是用来阐述没有 确定规律性的那部分 肽链结构。

蛋白质的三级结构 定义 : 整条肽链中全部氨基酸残基的相对 空间位置。即肽链中所有原子在三维空 间的排布位置。 主要的化学键 疏水键、离子键、氢键和 Van der Waals 力等。

模体与结构域 它们介于二、三级结构之间，是蛋白质发挥 生物活性的必需基本结构。 模体 (motif)—— 在许多蛋白质分子中，可发现 二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上 相互接近，形成一个特殊的空间构象。

钙结合蛋白中结 合钙离子的模体 锌指结构

结构域：蛋白质三级结构常可分割成一个或 数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密， 各行使其功能，称为结构域 (domain) 。 纤连蛋白分子的结构域

蛋白质的四级结构 有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条 多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基 (subunit) 。 蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位 的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。 亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键 和离子键。

血红蛋白四级结构 蛋白质亚基 组装方式丰 富多样

蛋白质构象改变导致疾病产生 蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错 误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构 象发生改变，仍可影响其功能，严重时可 导致疾病发生。 这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老 年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。

蛋白质构象改变导致疯牛病 疯牛病是由朊病毒蛋白 (prion protein, PrP) 引起 的一组人和动物神经退行性病变。 正常的 PrP 富含 α- 螺旋，称为 PrP c 。 PrP c 在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为 β- 折叠的 PrP sc ，从而致病。

PrP c α- 螺旋 PrP sc β- 折叠 正常疯牛病 正常疯牛病 疯牛病药物设计主要 是阻断 PrP sc 的产生

有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成 抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒 性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀 的病理改变。 蛋白质构象改变导致疾病的机理

蛋白质的变性 (denaturation) 定义：在物理和化学因素作用下，蛋白质空间构 象被破坏，即有序的空间结构变成无序的空间结 构，导致其理化性质改变和生物活性丧失。 本质：破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的 一级结构。 造成变性的因素：如加热、乙醇等有机溶剂、强 酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。

应用举例 临床医学上，变性因素常被应用来消 毒及灭菌。 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存 蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。

若蛋白质变性程度较轻，去除变性 因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢 复其原有的构象和功能，称为复性 (renaturation) 。 蛋白质的复性 (renaturation)

蛋白质样品大量制备 蛋白质样 品制备 体外：无细胞表达体系，用于对细胞 有毒性蛋白的表达 体内： ( E. Coli ) 可溶性表达： 30 ％ ( 根据 CESG 组织对 8038 个蛋白表达统计 ) 不可溶表达： 70% 蛋白以沉淀 形式表达；需进行蛋白质变性 与复性操作。

蛋白质结构测定一般方法  X- 射线晶体学 (X-Ray)  核磁共振 (NMR)

最终结构 X- 射线晶体学蛋白质结构解析流程 晶体生长晶体衍射 母晶 晶体重金属衍生物 晶胞参数 衍射强度和相位 两套以上不同 的衍射数据 傅里叶合成 电子密度图 根据结构模 型修正相位 碳骨架走向 氨基酸残基指认 结构模型 衍射强度 修正后的相位

如何制备蛋白质晶体？  利用蛋白质工程制备纯的蛋白质样品  制备饱和的蛋白质溶液  进行蛋白质结晶条件优化 liguofu 44

X 射线晶体学结构原理 This X-ray diffraction pattern of a DNA-cleaving enzyme was imaged at the facility by the Barry Stoddard group from the Fred Hutchinson Cancer Research Center

晶体质量与衍射仪决定数据分辨率 1.0 Å ：可分辩单个原子（ N 比 C 大） 2.5 Å ：可分辨环状状结构 3.0 Å ：不易可分辨环状状结构 4.0 Å ：很难确定是否环状结构. 1Å resolution 6Å resolution 6.0 Å ：可分辨 a -helix ，不能分辨 b sheet ≥8 Å ：只 能分辨分子 1.0Å 2.5Å 3.0Å 4.0Å

优点与缺点 X 射线晶体是目前最主要的研究生物大分子结 构的手段, 分辨率可以达到原子水平. 但它只能 给出研究对象的一个静态结构. 它没有分子量大小的限制，但太大的分子复合 体不易得到结晶. 样品的结晶是一个瓶颈, 尤其是膜蛋白的结晶 很难得到。 同步辐射光源应用提高了 X-ray 的衍射质量.

我国蛋白质晶体结构研究现况 1974 ：首次获得高分辨猪胰岛素的三维结构 2003 ： SARS 相关蛋白结构的系统研究 2004 ：菠菜主要捕光复合物晶体结构 2005 ：线粒体呼吸链膜蛋白复合物 II 的晶体结构 2003 ：北京高能所建成第一个蛋白质晶体学实验站 2009 ：上海同步辐射光源开始建设 现在： 清华大学施一公教授研究团队等工作 但在规模和投入上与发达国家相比仍有较大差距

SARS 病毒蛋白酶三维结构 2002 年冬到 2003 年春 肆虐全球的严重急性呼 吸综合征 (SARS) 爆发。 中国科学院院士、前 南开大学校长饶子和先 生解析了 SARS 病毒发 挥功能的主要蛋白酶结 构。 针对 SARS 病毒的药物设计主要以此为靶标进行

上海同步辐射光源 中国最大的大科学装置，在浦东张江高科技园区建 成并投入使用，总投资约 12 亿元。

核磁共振 (NMR) 技术用于蛋白质结构测定 1. 基因克隆 2. 表达与纯化 C 、 15 N 和 / 或 2 H 同位素标记 4. 三维及四维 NMR 图谱采集与信号归 属 5. 溶液三维结构确定

"for their development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological macromolecules" The Nobel Prize in Chemistry 2002 “for the development of methods for identification and structure analyses of biological macromolecules ” J.B.Fenn K. Tanaka USA Japan Kurt Wüthrich ETH, Switzerland "for his development of nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the three-dimensional structure of biological macromolecules in solution"

抗 HIV-1 病毒感染的 A3G 蛋白结构 X-ray NMR

优点与缺点 NMR 是目前仅次于 X 射线晶体学的研究生物大分子结构的 手段, 也具有很高的分辨率. 样品为溶液状态, 接近生理状态，且能测定动态结构，蛋 白质不需要结晶, 这是优点. 生物大分子 NMR 图谱非常复杂, 需要提高外磁场强度, 解 谱方法从一维发展到二维和三维才能保证分辨率得到提高。 NMR 受分子大小的限制, 目前低分辨率下分子量可达 50kDa 左右, 高分辨率下分子量可达 30kDa 左右.

超强磁场谱仪提高 NMR 信号灵敏度 2002 ：北京磁共振中心 (800 兆 ) 2007 ：中科院武汉磁共振中心 (800 兆 ) 2010: 中科院合肥强磁场中心 (850 兆 ) 2010: 北京首都医大强磁场中心 ( 800 兆 ) 2011: 中科院上海有机所强磁场中心 (800 兆 ) 2011: 中科院武汉磁共振中心 (850 兆 ) 2011: 上海蛋白质研究中心 (900 兆、 800 兆 ) 2011 ：中科院昆明植物所 (800 兆 ) 2011: 厦门大学 (850 兆 ) 2012 ：北京蛋白质研究中心 (900 兆、 800 兆 ) 大型科研设备的订购与国家 的经济实力密切相关. 30KDa 分子量以上的蛋白结 构解析需要 800 兆以上谱仪， 目前售价 1500 万人民币。

真诚祝福同学们 身心健康，心想事成！ 谢谢大家！