Leica CM1850 冷冻切片机的使用体会 组员： 李丹 吴哲 侯宇华

一. 总述 冷冻切片是借助在低温的条件下，使组织迅速冻结达到 一定硬度进行切片的一种方法。冷冻切片技术距今已近有 100 多年的历史，适用于新鲜样品的切片，包括动物的器 官如：心、肝、肾等；也可用于植物器官的切片，如根、 茎、叶等。与石蜡切片比，其优点在于快速、方便，切好 的片可直接染色处理。因此，制作一套高质量的冷冻切片 对于确保生物分析的科学性、可靠性是极其重要的。如今， 绝大多数的科研单位都有国产或国外的冷冻切片机，冷冻 切片已经成为日常工作中不可或缺的一部分。

二. 切片机使用原理 冷冻切片是借助低温使组织冻结达到一定的硬度并 通过冰起支撑作用来进行切片的一种方法。 速冻 可减小冰晶直径，避免组织细胞损伤。 制冷 压缩机佛里昂制冷、半导体温差电制冷

三. 切片机简介 1 冷冻切片机 CM 废液缸 3 控制面板 1 4 控制面板 2 5 储存架，左侧 6 储存架，右侧 7 自动总保险丝 8 固定吸热器（附件）支架 9 快速冷冻架 10 Peltier 元件（附件） 11 置物台（附件） * 12 固定吸热器（附件） * 13 标本盘 14 隔热板（附件） 15 切片废料盘 16 刷架 17 可定向的标本头 18 刀架基座（附件） 19 刀架 CE （附件） 20 刀架 CN （附件） 21 刀架 CS （附件）

控制面板一 灯光按钮 ON/OFF 开关用于冷冻箱照明。 手动除霜按钮 用于激活和终止手动除霜。 锁定按钮 锁定解锁定控制面板以避免无意修改输入的参数。 要锁定或解锁定，按下约 5 秒。

设置时间 设置自动除霜时间

选择冷冻箱温度 快速冷冻架的手动除霜

控制面板二 将标本远离刀片 按下后标本开始向后部末端快速返回。 当标本头运动时， LED （ 1 ）闪烁。 到达后部末端时， LED （ 1 ）开始发光。 可以通过按下粗进料按钮之一停止往返运动。 按下后标本开始向后部末端慢速返回。 标本会向后部末端缓慢移动，只要按钮处于 按下状态。 向刀片移动标本 按下标本向着刀片快速或慢速移动。 只要按钮按下就进行向前的移动。 这是一项 安全特性保 护标本和刀片免于损坏！ 到达前部末端时，按钮的 LED （ 2 ）开始发光。

快速冷冻架 冷冻箱具有一个快速冷冻架可以放置多达 10 个标本盘。 快速冷冻架的温度通常都低于冷冻箱温度。 将标本切至一定大小。 室温下添加足量冷冻化合物与标本盘中。 将标本置于盘中并定向。 将标本盘置于快速冷冻架的一个孔中，在 低温下冷冻标本。 标本冷冻后，将标本盘插入标本头上并开 始切片。

标本盘 将标本盘插入标本头 将手轮的把手锁定于较高的位置。 刀架和刀都到位后，用护刀器覆盖 在 刃缘上。 松开标本头的螺丝。 将标本盘的轴插入刀标本头的定 位孔中。 确定标本盘的轴已完全插入。棱柱 全部后 表面必须与标本头良好接触。 重新旋紧螺丝。 标本定向 要放开标本，松开螺丝。 用控制杆确定标本面的方向。 重新旋紧螺丝。

切片 修整标本 将预冷的刀 / 刀片插入并固定在刀架上。 调整适当的刀架间隙角。 对于大多数情况而言，调整到 4° 和 6° 之间（刀架 CN 和 CS ）或 1° 和 2° 之间（刀架 CE ）是合适的。 将刀架 / 刀与标本准直。 拆下护刀器（刀架 CN 、 CS ）或向左折叠玻璃防倾 导杆（刀 架 CE ）。 打开手轮。 用粗进料按钮将标本移向刀片修整标本。旋转手轮 降低 标本至需要的切片平面。 在刀上放置防倾导杆并与刃缘准直。

切片厚度设置 通过旋转旋钮可以在 1 到 60um 的范围内调整 切片 厚度： 从 0-10um,1um 增幅。 从 10-20um,2um 增幅， 从 20-60um,5um 增 幅。 选择的切片厚度显示在切片机的指示标记上。 用切片机上的控制旋钮选择需要的切片厚度。 用约 20um 的厚度开始切片。 将切片厚度连续降低到合适数值。 从某一切片厚度变换到另一厚度时，应当舍 弃前两三个切片。 切片时，匀速旋转手轮。

四. 方法 冷冻切片机操作方法 1. 取材。 2. 取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻 台上，冰冻。 3. 将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转 动旋钮，将组织修平。 4. 调好欲切的厚度，一般在 5 ～ 10um 间。 5. 调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要 求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切 片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道， 平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻 片，将其附贴上即可。

注意事项： 1. 防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切 片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一 次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂 粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。 2. 放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓 “ 砍柴看柴势 ” ， 切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。 3. 组织块不须经各种固定液固定。 4. 当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来， 在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压 组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。 5. 用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为 当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温 度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物 质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产 生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷 藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。

实例 取材 将未经过任何试剂处理的新鲜组织标本切成 2*cm*2cm*0.2cm 大小的 组织块，尽量切掉四周多余的脂肪或坏死组织，切面要平整。 包埋、冷冻 将取好的标本放在加入包埋剂（胶水）的标本盘上，置于冷冻架上， 当组织块表面也呈现白色时表示组织已完全冻结，即可切片。 切片 切片时先利用左侧操作界面的快进退按钮来调节组织块和切片刀的位 置，直到组织块贴近刀片时，用慢进按钮开始深修组织块至最大面， 注意观察有无包膜、结节等。有包膜的一定要切完整，小的结节或重 点病变部位要切到，避免漏诊、误诊。放下防卷板，开启负压系统， 转动手轮切片，将切好的组织贴附于干净的载玻片上。

固定 固定液选用 AAF 固定液。固定对染色起着决定性的作用，切片后需立即固 定，如固定不及时，组织容易退变，做出的切片不清晰。固定液要新鲜， 根据组织情况决定固定时间。 染色及封固 染色方法为 HE 染色法，步骤为：切片水洗 → 苏木精 2~3min→ 水洗 →1% 盐酸乙醇分化 → 水洗 → 热水蓝化 → 水洗 →80% 乙醇脱水 → 伊红 10s→ 依次梯度乙醇脱水 → 二甲苯透明 → 中性树胶封固。 染色液需定期更换，尤其要注意保证苏木精的染色力，保证制片质量。 染色示样 切片完整无皱褶，无刀痕，无裂隙空洞，染色鲜明，对比清晰， 细胞核蓝色、胞质纤维和肌肉等呈现深浅不同的红色，红细胞可呈鲜 亮的橘红色。组织结构清晰，接近石蜡切片染色结果。

图 1 淋巴结冷冻切片 图 2 皮肤恶黑冷冻切片 图 3 脂肪冷冻切片

冰冻切片机的清洁保养 冷冻箱内的清洁保养 冷冻箱内安装冰冻切片机的功能部件, 是制作冰冻 切片的场所, 完成冰冻病理切片后对机器的主要功能部件应及时进行清洁, 保持冷冻箱内干净整洁。切片刀的刀架和刀座要定期清洁, 清洁时先将冷冻 箱内清扫干净, 然后才能切断切片机的电源, 待切片机由低温状态恢复到室 温后, 再将刀架及刀座分别卸下用清水冲洗干净、晾干, 完全干燥后再重新 组装, 调整合适切片刀的角度并旋紧各组螺丝固定稳固。另外, 机箱内的固 定部件 ( 不能拆卸 ) 在清扫干净后, 用纱布蘸清水擦拭干净, 打开冷冻箱箱盖, 待箱内设备充分干燥后将箱盖关闭, 最后将电源接通, 检查温度控制器是否 设定在正确位置。彻底清洁后给机器加防冻润滑油进行保养, 延长机器使用 寿命。 压缩机的清洁保养 压缩机是冰冻切片机的心脏, 通常位于切片机的背面, 摆放切片机时要注意在切片机后留有一定空间, 以便空气流通机器散热。由 于压缩机在机器的背面, 清洁容易被忽视, 如果压缩机外面沾上了灰尘, 会直 接影响机器散热, 导致冰冻切片机的使用寿命缩短, 制冷效果也会随之减弱。 这就需要在使用过程中定期检查, 注意散热器缝隙之间要彻底清洁。