氨基酸转换反应 ( 一 ) 血液中转氨酶活力的测定 一. 目的 : 了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临 床诊断中的意义, 学习转氨酶活力测定的原理和方 法。 二. 原理 : 生物体内广泛存在的氨基转换酶也称转氨酶, 能 催化 α – 氨基酸的 α – 氨基与 α – 酮基互换, 在氨基酸 的合成和分解尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中 有重要作用。转氨酶的最适 pH 接近 7.4 ，它的种类 甚多，其中以谷氨酸 - 草酰乙酸转氨酶和谷氨酸 - 丙 酮酸转氨酶的活力最强。
正常人血清中只含有少量转氨酶。当发 生肝炎，心肌梗死等病患时，血清中转氨酶 活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶 活力的测定有重要意义。 测定转氨酶活力的方法很多，本试验采 用分光光度法。谷丙转氨酶作用于丙氨酸和 α – 酮戊二酸后，生成的丙酮酸与 2 ， 4- 二硝 基苯肼作用生成丙酮酸 2 ， 4- 二硝基苯腙。
丙酮酸 2 ， 4- 二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，可用 分光光度法测定。从丙酮酸 2 ， 4- 二硝基苯腙的生成 量，可以计算酶的活力。
三. 器材 1. 试管及试管架 2. 吸管 3. 恒温水浴 4. 分光光度计
四. 试剂和材料 摩尔 / 升磷酸缓冲液 (pH7.4) 250 毫升 微摩尔 / 毫升丙酮酸钠标准溶液 毫升 3. 谷丙转氨酶底物 150 毫升 4.2,4- 二硝基苯肼溶液 150 毫升 当量 / 升氢氧化钠溶液 1200 毫升 6. 人血清
五. 操作方法 一. 标准曲线的绘制 : 取 6 支试管, 分别标上 0,1,2,3,4,5 六个号. 按下表所列次序添加各试剂. 试管号 试剂 丙酮酸钠标准液 _ 谷丙转氨酶底物 磷酸缓冲液 0.1 摩尔 / 升 pH
2,4- 二硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形 成苯腙. 底物中的 α- 酮戊二酸与 2,4- 二硝基苯肼反 应, 生成 α- 酮戊二酸苯腙. 因此, 在制作标准曲线时, 须加入一定量的底物 ( 含 α- 酮戊二酸 ) 来抵消由 α- 酮 戊二酸产生的消光影响. 先将试管置于 37 0 C 恒温水浴中保温 10 分钟以 平衡内外温度. 向各试管内加入 0.5 毫升 2,4- 二硝基 苯肼溶液后再保温 20 分钟, 最后, 分别向各试管内 加入 0.4 当量 / 升氢氧化钠溶液 5 毫升。在室温下静 置 30 分钟, 以 0 号管作空白, 测定 520 毫微米的光吸 收值。用丙酮酸的微摩尔数为横坐标, 光吸收值为 纵坐标, 画出标准曲线。
2. 酶活力的测定 取 2 支试管并标号，用第一号试管作为未知管，第 2 号试管作为空白对照管。各加入谷丙转氨酶底物 0.5 毫升，置于 37 0 C 水浴内 10 分钟，使馆内外温度平衡。 取血清 0.1 毫升加到第 1 号试管内，继续保温 60 分钟。 到 60 分钟时，向两支试管内各加入 2,4- 二硝基苯肼试 剂 0.5 毫升，然后再向第 1 ， 2 号管中加入 0.4 当量 / 升 氢氧化钠溶液 5 毫升。在室温下静置 30 分钟后，测定 未知管的 520nm 吸收值。在标准曲线上查出丙酮酸 的微摩尔数。（用 1 微摩尔丙酮酸代表 1.0 单位酶活 力）。计算每 100 毫升血清中转氨酶的活力单位数。
721 型分光光度计的使用 本仪器在可见光谱区范围内（ 360~800nm ）进行定量比色分析用。 1 ．在仪器尚未接通电源时，电表的指针必须位于透光 率 “0” 刻线上，若不是这种情况，可以用电表上的校 正螺丝进行调节。 2 ．接通电源，调节波长，放大器灵敏度旋钮打在第一 档。仪器预热 20 分钟。 3. 将装有溶液的比色皿放入比色皿槽中, 同时使对照溶 液置于光路.
4 ．打开样品室盖 ( 光门自动关闭 ), 调节 “0” 旋钮, 使数 字显示 “00.0” 5 ．关上样品室盖, 调节透光率 “100%” 旋钮, 使数字显 示 “100.0”. ( 如调不到 “100.0” 数值, 则将灵敏度旋钮调 高一档后, 重复上述 “0” 与 “100%” 旋钮的调节. 6. 重复三次上述 “0” 与 “100%” 旋钮的调节. 7 ．将被测样品置于光路, 测量并读数。
注意事项： （ 1 ）不可用手、滤纸、毛刷等摩擦透光面，只能用绸 布和擦镜纸擦。 （ 2 ）比色皿内液体不可过多或过少，在 2/3~3/4 之间, 且不能有气泡, 悬浮物。 （ 3 ）测量时拉动拉杆要轻。 开关样品室盖 要轻拿轻 放.