氨基酸 顾军 北京大学生命科学院

内 容 氨基酸-蛋白质的构件分子 氨基酸的分类 氨基酸的酸碱化学 氨基酸的化学反应 氨基酸的光学活性和光谱性质 氨基酸混合物的分析分离

氨基酸的性质 聚合能力 酸碱性质 侧链的结构 手性

蛋白质的水解 完全水解：氨基酸的混合物 部分水解：肽段和氨基酸

蛋白质的水解 酸水解： 6MHCl或4MH2SO4 不消旋，得到L-氨基酸；色氨酸破坏、羟基氨基酸部分分解、天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基。 在酸、碱、蛋白酶的作用下，可以被水解成氨基酸单体。 酸水解： 6MHCl或4MH2SO4 不消旋，得到L-氨基酸；色氨酸破坏、羟基氨基酸部分分解、天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基。

蛋白质的水解 碱水解： 多数氨基酸遭到不同程度的破坏，消旋，得到D-,L-型氨基酸的混合物；色氨酸稳定、精氨酸脱氨 5MNaOH

蛋白质的水解 酶水解： 不消旋、不破坏氨基酸、需要多种酶的协同作用；水解位点特异，水解时间长。用于一级结构分析

L-氨基酸的基本结构 COOH H2N C H R 二十种氨基酸除Gly外全是L-型。 α碳原子,不对称碳原子 侧链 Chiral carbon 残基：在肽链中每个氨基酸都脱去一个水分子，脱水后的残余部分叫残基（residue), 因此蛋白质肽链中的氨基酸统统是残基形式。

氨基酸的结构

肽 键 一分子氨基酸的α－羧基和一分子氨基酸的α－氨基脱水缩合形成的酰胺键，即-CO-NH-。氨基酸借肽键联结成多肽链。

肽 键 蛋白质分子中的主要共价键，性质比较稳定。单键，具有部分双键的性质，难以自由旋转而有一定的刚性，因此形成肽键平面，包括连接肽键两端的C═O、Ｎ－Ｈ和2个Cα共6个原子的空间位置处在一个相对接近的平面上。一条多肽链的一端含有一个游离的氨基,另一端含有一个游离的羧基.

氨基酸的性质 中性环境：兼性离子 旋光性 a-氨基酸：白色晶体、熔点高，不同氨基酸有特殊的晶型 一般能溶于水（胱氨酸和酪氨酸除外）

氨基酸的分类 1809年发现Asp，1938年发Thr，目前已发现180多种。但是组成蛋白质的aa常见的有20种，称为基本氨基酸（编码的蛋白质氨基酸），还有一些称为稀有氨基酸，是多肽合成后由基本aa经酶促修饰而来。 非蛋白质氨基酸 蛋白质氨基酸

R基的化学结构分 脂肪族 芳香族 杂环族 脂肪族氨基酸最多

R基的化学结构分 R为脂肪烃基的氨基酸（5种）Gly、Ala、Val、Leu、Ile、 R基均为中性烷基（Gly为H），R基对分子酸碱性影响很小，它们几乎有相同的等电点。（6 .0±0.03） Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，不具旋光性。从Gly至Ile，R基团疏水性增加，Ile 是20 种a.a 中脂溶性最强的之一（除Phe 、Trp 、Tyr 外）。

R中含有羟基和硫的氨基酸（4种） 含羟基的有两种：Ser和Thr。 Ser的-CH2 OH基（pKa=15），在生理条件下不解离，但它是一个极性基团，能与其它基团形成氢键，具有重要的生理意义。在大多数酶的活性中心都发现有Ser残基存在。

Thr 中的-OH是仲醇，具有亲水性，但此-OH形成氢键的能力较弱，因此，在蛋白质活性中心中很少出现。Ser和Thr的-OH往往与糖链相连，形成糖蛋白。 含硫的两种：Cys、Met。

Cys 具有两个重要性质 （1）在较高pH值条件，巯基离解。 （2）两个Cys的巯基氧化生成二硫键，生成胱氨酸。Cys—s—s—Cys。二硫键在蛋白质的结构中具有重要意义。 Cys还常常出现在酶的活性中心。Met的R中含有甲硫基（-SCH3），硫原子有亲核性，易发生极化，因此，Met是一种重要的甲基供体。

R中含有酸性基团及酰胺（4种） Asp、Glu，一般称酸性氨基酸 Asp侧链羧基pKa（β-COOH）为3.86，Glu侧链羧基pKa（γ-COOH）为4.25，在生理条件下带有负电荷的仅有的两个 氨基酸。

R中含碱性基团（2种） Lys的R侧链上含有一个氨基，侧链氨基的pKa为10.53。生理条件下，Lys侧链带有一个正电荷（—NH3+），同时它的侧链有4个C的直链，柔性较大，使侧链的氨基反应活性增大。（如肽聚糖的短肽间的连接）

Arg是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱，pKa值为12.48，生理条件下完全质子化。和尿素的形成有关

R中含有芳基的氨基酸（3种）Phe、Tyr 、Trp 具有共轭π电子体系,易与其它缺电子体系或π电子体系形成电荷转移复合物( charge-transfer  complex)或电子重叠复合物。在受体—底物或分子相互识别过程中具有重要作用。

这三种氨基酸在紫外区有特殊吸收峰，蛋白质的紫外吸收主要来自这三种氨基酸，在280nm处，Trp＞Tyr＞Phe。

Phe疏水性最强。 L—苯丙氨酸是生产阿斯巴甜的主要原料。阿斯巴甜是经世界卫生组织（WHO）、粮农组织（FAO）专家联席委员会认定的A（1）级安全性食品添加剂，具有甜味纯正、高甜度、营养丰富矫味增鲜等特点，其甜度是蔗糖的200倍，热值不到其二百分之一，是高血压、心脏病、糖尿病人最理想的甜味剂。 浓度的测定用于苯丙酮尿症的诊断

氨基酸为载体把抗癌药物的分子或基因导入癌瘤区，就能达到既抑制癌瘤生长，又能降低原肿瘤药物的毒副作用，而这些氨基酸载体中以L—苯丙氨酸为最理想，其效果是其他氨基酸的3——5倍

酪氨酸的-OH磷酸化是一个普遍的调控机制，Tyr在较高pH值时，酚羟基离解 Trp有复杂的π共轭休系，比Phe和Tyr更易形成电荷转移络合物。

R为环状的氨基酸（2种）Pro( His) Pro是一种环状结构的氨基酸，它的α-亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构。它在蛋白质空间结构中具有极重要的作用，一般出现在两段α-螺旋之间的转角处，Pro残基所在的位置必然发生骨架方向的变化。

His含咪唑环，咪唑环的pKa在游离氨基酸中和在多肽链中不同，前者pKa为6. 00，后者为7 His含咪唑环，咪唑环的pKa在游离氨基酸中和在多肽链中不同，前者pKa为6.00，后者为7.35，它是20种氨基酸中侧链pKa值最接近生理pH值的一种，在接近中性pH时，可离解平衡。它是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。

必需氨基酸： 成年人：Leu、Ile、Val、Thr、Met、Trp、Lys、Phe 婴儿期：Arg和His供给不足，属半必需氨基酸。 必须氨基酸在人体内不能合成，是由于人体内不能合成这些氨基酸的碳架（α-酮酸）

9种人体必需氨基酸的记忆口诀 　　①"借一两本蛋色书来" 谐音: 借(缬氨酸), 一(异亮氨酸),两(亮氨酸),本(苯丙氨酸),蛋(蛋氨酸),色(色氨酸),书(苏氨酸),来(赖氨酸).　　

　②"笨蛋来宿舍，晾一晾鞋" 笨（苯丙氨酸）蛋（蛋氨酸）来（赖氨酸）宿（苏氨酸）舍（色氨酸），晾（亮氨酸）一晾（异亮氨酸）鞋（缬氨酸）

③＂携带一两本甲硫色书来＂ 　携（缬氨酸）带一（异亮氨酸）两（亮氨酸）本（苯丙氨酸）甲硫（甲硫氨酸）色（色氨酸）书(苏氨酸)来(赖氨酸)

20种氨基酸的发现年代表 天冬酰氨 1806 Vauquelin 天冬门芽 甘氨酸 1820 Braconnot 明胶 氨基酸发现年代表 20种氨基酸的发现年代表 天冬酰氨 1806 Vauquelin 天冬门芽 甘氨酸 1820 Braconnot 明胶 亮氨酸 1820 Braconnot 羊毛、肌肉 酪氨酸 1849 Bopp 奶酪 丝氨酸 1865 Cramer 蚕丝 谷氨酸 1866 Ritthausen 面筋 天冬氨酸 1868 Ritthausen 蚕豆 苯丙氨酸 1881 Schultze 羽扇豆芽 丙氨酸 1881 Weyl 丝心蛋白 赖氨酸 1889 Drechsel 珊瑚 精氨酸 1895 Hedin 牛角 组氨酸 1896 Kossel,Hedin 奶酪 胱氨酸 1899 Morner 牛角 缬氨酸 1901 Fischer 奶酪 脯氨酸 1901 Fischer 奶酪 色氨酸 1901 Hopkins 奶酪 异亮氨酸 1904 Erhlich 纤维蛋白 甲硫氨酸 1922 Mueller 奶酪 苏氨酸 1935 McCoy et al 奶酪

氨基酸的名称与符号 不用的字母 JUZBOX 要求： 能倒背 alanine 丙氨酸 Ala A arginine 精氨酸 Arg R 氨基酸名称与符号 氨基酸的名称与符号 alanine 丙氨酸 Ala A arginine 精氨酸 Arg R asparagine 天冬酰氨 Asn Asx N aspartic acid 天冬氨酸 Asp Asx D cysteine 半胱氨酸 Cys C glutamine 谷氨酰胺 Gln Glx Q glutamic acid 谷氨酸 Glu Glx E glycine 甘氨酸 Gly G histidine 组氨酸 His H isoleucine 异亮氨酸 Ile I leucine 亮氨酸 Leu L lysine 赖氨酸 Lys K methionine 甲硫氨酸 Met M phenylalanine 苯丙氨酸 Phe F proline 脯氨酸 Pro P serine 丝氨酸 Ser S threonine 苏氨酸 Thr T tryptophan 色氨酸 Trp W tyrosine 酪氨酸 Tyr Y valine 缬氨酸 Val V 不用的字母 JUZBOX 要求： 能倒背

非极性芳香族侧链氨基酸 苯丙氨酸、脯氨酸和色氨酸

介于极性与非极性之间

要求全部背出 二十种氨基酸的化学结构

20种标准氨基酸的物化性质

其他氨基酸的结构

出现在蛋白质上的氨基酸修饰 4-Hydroxyproline 在胶原蛋白上; 5-Hydroxylysine, 6-N-methyllysine, desmocine 在结缔组织中; Phospho-Ser, -Thr, -Tyr 信号转导蛋白; γ-Carboxyglutamic acid 凝血酶中; Pyroglutamic acid 神经肽的N端;

修饰型氨基酸1 蛋白质中的氨基酸修饰 1 从各种生物分离到的氨基酸已达250种以上 大量出现在胶原蛋白 结缔组织 羟赖氨酸

修饰型氨基酸2 蛋白质中的氨基酸修饰 2 结缔组织

修饰型氨基酸3 蛋白质上的氨基酸修饰 3 凝血酶 信号传导

氨基酸衍生物 游离型氨基酸衍生物 4 Pyroglutamic acid (焦谷氨酸), 神经肽的N端多数为焦谷氨酸

游离型氨基酸衍生物 21号和22号primary amino acid Ornithine; Citrulline 5’-Hydroxytryptophan Homoamino acids 3,4-Dihydroxyphenylalanine (DOPA) γ-Aminobutyric acid (GABA) Mono, di, tri-iodotyrosine; thyroxine β - Alanine,……etc

游离型氨基酸衍生物 1 SeC, 硒半胱氨酸 第21个一级氨基酸? PyL(吡咯赖氨酸), 第22个一级氨基酸? 游离型氨基酸衍生物 1 SeC, 硒半胱氨酸 第21个一级氨基酸? Hao, B., et al. A novel UAG encoded residue in the structure of a methanogen methyltransferase. Science 296: 1462-1466, 2002. PyL(吡咯赖氨酸), 第22个一级氨基酸?

氨基酸衍生物 游离型氨基酸衍生物 2 鸟氨酸 (存在于尿素循环) 瓜氨酸 (存在于尿素循环,从西瓜汁分离到)

游离型氨基酸衍生物 3 （5-羟色氨酸） 5’-hydroxytryptophan HO “The taste of love” 游离型氨基酸衍生物 3 5’-hydroxytryptophan （5-羟色氨酸） “The taste of love” 是松果体素 ( 褪黑素, melatonin) 和 血清素(serotonin) 的前体。 HO

游离型氨基酸衍生物 4 比通常的氨基酸多一个甲基， 如 Homoserine 微生物、植物的代谢中间产物 Homocysteine 游离型氨基酸衍生物 4 比通常的氨基酸多一个甲基， 如 Homoserine 微生物、植物的代谢中间产物 Homocysteine Homocitrulline 摄取高Lys含量的食物时从尿中排出 Homomethionine* 非天然产物 Met的分解产物，存在于S-adenosylhomo-cysteine和叶酸中. Homocysteine Methionine

游离型氨基酸衍生物 5 DOPA,多巴 从Tyr衍生出来的重要生理物质， 其中多巴是一种氨基酸。 Dopamine, 多巴胺 游离型氨基酸衍生物 5 tyrosine Epinephrine, 肾上腺素 S-adenosylhomocysteine S-adenosylmethionine DOPA,多巴 3,4-dihydroxyphenylalanine norepinephrine 去甲肾上腺素 从Tyr衍生出来的重要生理物质， 其中多巴是一种氨基酸。 Dopamine, 多巴胺 3,4-dihydroxyphenylethylalanine

游离型氨基酸衍生物 6 味精是神经递质GABA的直接前体 glutarmic acid GABA, γ-aminobutyric acid 游离型氨基酸衍生物 6 glutarmic acid GABA, γ-aminobutyric acid 过量促进食欲, 促肥胖 味精是神经递质GABA的直接前体 S-adenosylmethionine S-adenosylhomocysteine carnitine, 肉毒碱（可用来减肥）

游离型氨基酸衍生物 7 甲状腺内贮存碘的氨基酸 monoiodotyrosine tyrosine diiodotyrosine 游离型氨基酸衍生物 7 monoiodotyrosine tyrosine 甲状腺内贮存碘的氨基酸 diiodotyrosine tetraiiodotyrosine (thyroxine) triiodotyrosine

氨基酸的理化性质

氨基酸的理化性质 一般物理性质 无色晶体，熔点较高（200～300℃） ，水中溶解度各不同，取决于侧链。 氨基酸的理化性质 一般物理性质 无色晶体，熔点较高（200～300℃） ，水中溶解度各不同，取决于侧链。 在紫外有特征吸收的仅三个芳香族的氨基酸Trp、Tyr、Phe, 利用这一特点，可以通过测定280nm处的紫外吸收值的方法对蛋白溶液进行定量。

有紫外特征吸收的氨基酸 Trp, Tyr和Phe的紫外吸收

光吸收的测定 紫外光吸收的测定装置

氨基酸作为两性电解质 氨基酸的理化性质 两性电解质 同一个氨基酸分子上可以同时携带正电荷和负电荷，称为两性电解质ampholyte。

氨基酸的酸碱性质 根据酸碱质子理论，HA A- ＋ H+ 氨基酸是两性电解质，既是质子供体，又是质子受体。当氨基酸完全质子化时，可看作是多元酸；COOH和NH3+可以发生解离，用Ka表示它们的解离常数； 在氨基酸溶液中，pH值计算公式如下： pH=pKa＋lg（[质子受体]/[质子供体]）

侧链不解离的中性氨基酸看作二元酸 酸性氨基酸和碱性氨基酸看作三元酸

Ka1 Ka2 + + A- A+ A0 A0 [A0] [H+] [A-] [H+] Ka1= Ka2= [A+] [A0] pH=pKa＋lg（[质子受体]/[质子供体]） 当 ， pH=pKa1 [A0] = [A+] 当 [A0]=[A-] ， pH=pKa2

氨基酸的酸碱滴定 氨基酸的酸碱滴定曲线 0.1HCl 0.1HCl

pK值的变化 解离基团的pK值会发生较大的变化

等电点 (isoelectric point, pI) 氨基酸、多肽等两（兼）性电解质[ampholyte]在溶液中所携带的净电荷 [net electric charge]为零时的溶液的pH值。因此也叫isoelectric pH. 氨基酸带电状况与溶液的pH有关。当pH大于等电点时，氨基酸带净负电荷；当pH小于等电点时，氨基酸带净正电荷！在一定的pH范围内，氨基酸溶液的pH离等电点愈远，氨基酸所携带的净电荷愈大。

氨基酸的甲醛滴定 氨基酸酸碱滴定的等电点pH 过高或过低，没有适宜的指示剂，因此，氨基酸虽然是两性电解质，但不能直接用酸碱滴定。 在氨基酸中加入甲醛，甲醛与氨基酸中的氨基作用形成羟甲基衍生物，降低了氨基的碱性，使滴定终点移动。

氨基酸的旋光性与光谱性质 氨基酸的旋光性： 氨基酸的构型（指α-碳）也以甘油醛为参考物，从蛋白质的酸水解或酶水解液中得到的都是L型，但D型氨基酸在自然界也存在；蛋白质用碱水解或有机合成氨基酸时，得到的都是无旋光性的DL-消旋物

L型和D型的由来 甘油醛的旋光性 左旋甘油醛的构型 右旋甘油醛的构型 按原子序数法确定了L型和D型氨基酸，但现在L和D已经不代表氨基酸的旋光性，只代表氨基酸的绝对构型。

现在为了正确表示左旋和右旋，采用（＋）和（－）的符号，（＋）代表右旋，（－）代表左旋。从右旋的D型甘油醛出发，可以合成出左旋的D型乳酸。可以看出物质的旋光性与手性原子上的构型没有确定的关系。

L和D型氨基酸 L型氨基酸 与 D型氨基酸 L- amino acid D- amino acid

“ D/L”判断法 （看CAR的走向） A C C R L型 D型 A R 将H原子靠近自己，观察CAR的走向，逆时针（左转）为L型，顺时针（右转）为D型。 D：dextro 右 C：carboxyl group ; L： levo 左 A：amino group ; R：residue ; 拉丁语中 A C C R L型 D型 A R

苏氨酸的异构体 苏氨酸 Thr 有四种异构体

半胱氨酸Cysteine和胱氨酸Cystine 二硫键 Disulfide bond

氨基酸的旋光符号和大小取决于R基的性质，与测定溶液的pH有关。 比旋是ɑ-氨基酸的物理常数，是鉴别各种氨基酸的依据之一

氨基酸的光谱性质： 参与蛋白质组成的20多种氨基酸在可见光区没有光吸收，在红外区和远紫外区都有光吸收，但在近紫外区只有芳香族氨基酸有光吸收；

氨基酸的主要化学反应

氨基酸的化学反应 与亚硝酸反应（生成羟基氨基酸和氮气） 与酰化试剂反应（氨基被酰基化而被保护） α-氨基参加的反应 烃基化反应 DNFB反应（生成DNP-氨基酸） PITC反应（生成PTH-氨基酸） 形成西佛碱反应（与醛类化合物） 脱氨基反应

成盐成酯 成酰氯（与二氯亚砜等） α-羧基参加的反应 脱羧基反应 叠氮反应（氨基酸酯与肼、亚硝酸） 与茚三酮反应（氨与还原茚三酮发生作用生成紫色物质） α-氨基与α-羧基共同参加反应 成肽反应 酪氨酸酚羟基 组氨酸咪唑 侧链R基参加的反应 精氨酸胍基 色氨酸吲哚基 半胱氨酸巯基

取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高 酰化反应 H2N—CH—COOH + R N CH3 O=S=O Cl 5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl） pH9.7 40℃ N CH3 O=S=O HN—CH—COOH R DNS-氨基酸 取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高

氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应 （sanger反应） + 氨基酸 DNFB（dinitrofiuorobenzene） 弱碱中 DNP-AA(黄色) + HF

氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应 （Edman反应） + PITC（phenylisothiocyanate） 弱硷中 (400 C) 苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA） (硝基甲烷 400 C) H+

α-羧基参加的反应 成盐成酯 成酰氯（与二氯亚砜等） 脱羧基反应 叠氮反应（氨基酸酯与肼、亚硝酸）

氨基酸的化学性质 脱羧反应 NH2 I R-CH-COOH------R-CH2-NH2+CO2

成酰氯反应 氨基被保护后，羧基可与二甲亚砜或五氯化磷作用生成酰氯。

α-氨基与α-羧基共同参加反应 与茚三酮反应（氨与还原茚三酮发生作用生成紫色物质） 成肽反应

氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还原型茚三酮。 加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮。 NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。 3

脯氨酸与羟脯氨酸与茚三酮反应生成 亮黄色化合物，最大吸收在440nm处。 注意： 脯氨酸与羟脯氨酸与茚三酮反应生成 亮黄色化合物，最大吸收在440nm处。

侧链R基参加的反应 酪氨酸酚羟基 组氨酸咪唑 精氨酸胍基 色氨酸吲哚基 半胱氨酸巯基

酪 氨 酸 酚 羟 基 米伦反应（Millon）：酚基与HgNO3、与Hg（NO3）2 和HNO3 作用呈红色。与浓硝酸作用生成黄色。 酪 氨 酸 酚 羟 基 米伦反应（Millon）：酚基与HgNO3、与Hg（NO3）2　和HNO3　作用呈红色。与浓硝酸作用生成黄色。 Pauly反应：酚基与重氮化合物反应生成橘黄色化合物。 Trp苯环------红色

精氨酸的胍基 坂口反应（Sagakuchi）：胍基与α-萘酚，次溴酸盐作用生成红色物质。

Cys侧链上的巯基（－SH） 在微碱性pH下－SH 基解离成 “－CH2－S –” (1)与卤化烷生成稳定的烷基衍生物 (2)巯基能打开氮丙啶的环  保护 -SH 以防被氧化  侧链似赖氨酸，为胰蛋白酶水解肽链提供了新位点。

(3) 巯基能和各种金属离子形成络合物 是蛋白质结晶学中制备重原子衍生物方法之一。 -SH 酶遇到重金属离子而生成硫醇盐时，将导致酶失活 (4)巯基易受空气或其他氧化剂氧化 硫醇的两种氧化衍生物：二硫化物和磺酸基过甲酸

二硫键在稳定蛋白质的构象上起作用。 二硫键的打开 氧化剂：HCOOOH 还原剂：巯基乙醇、巯基乙酸、二硫苏糖醇等

侧链R基参加的反应 蛋白质的化学修饰 在温和的条件下，以可控制的方式使蛋白质与某种试剂发生特异反应，引起蛋白质个别氨基酸侧链或官能团发生共价化学改变。用于结构与功能的研究

氨基酸混合物的分析分离 分离方法 柱层析 纸层析（相对迁移率，非极性性质） 薄层层析 离子交换层析（电荷和非极性） 气相层析 高效液相层析 氨基酸洗脱顺序的判定：氨基酸与树脂的亲合力主要决定于它们之间的静电吸引，其次是氨基酸侧链与树脂聚苯乙烯之间的疏水相互作用；亲和力愈大愈难洗脱！

层析分离 根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。共同特点:一个固定相和流动相，当蛋白质混合溶液(流动相)通过装有珠状或基质材料的管或柱(固定相)时，由于混合物中各组份在物理化学性质(如吸引力、溶解度、分子的形状与大小、分子的电荷性与亲和力)等方面的差异使各组分在两相间进行反复多次的分配而得以分开。流动相的流动取决于引力和压力，不需要电流。

用层析法可以纯化得到非变性的、天然状态的蛋白质。层析方法中凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等是目前最常用的层析方法。

层析原理 分配定律 :Kd=cA/cB 有效分配系数：Keff=某物质在A相中的总量/某物质在B相中的总量 Keff=Kd*Rv, Rv=VA/VB

逆流分配（反流分布法） 是连续操作的多次液一液提取的分离方法。被分离的各个组分在两种不相混溶的溶剂中有不同的分配系数，以不同程度分配在两相中，其中一个相不断地向前移动，同时不断添加新鲜溶剂进行提取，经过多次操作后即可将复杂混合物分离。此法需要经过多次振摇提取，因而逆流分配代谢是由大量容器管连接组成，采用自动操作、自动提取分离。逆流分配仪体积较大，比较复杂，在使用上受到一定限制

物质Y(Kd=1) 的分配情况 溶剂 A 溶剂 B 总量 64 64 32 平衡后 总量 64 16 16 转移1 总量 32 32 8 总量 64 16 16 转移1 总量 32 32 8 16 8 转移2 总量 16 32 16 4 12 12 4 转移3 总量 8 24 24 8 2 8 12 8 2 转移4 总量 4 16 24 16 4 分管号码 1 2 3 4 5

因此层析载体的粒径越小，分离效果越好。这就是为什么要发展高效液相色谱（HPLC） 理论塔板决定层析效果 理论塔板数与粒子半径成反比 因此层析载体的粒径越小，分离效果越好。这就是为什么要发展高效液相色谱（HPLC）

理论塔板数 将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间为固定相占据，另一部分空间充满流动相。组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。并假定在每一小段内组分可以很快地在两相中达到分配平衡，这样一个小段称作一个理论塔板（theoretical plate），一个理论塔板的长度称为理论塔板高度（theoretical plate height）H。由于色谱柱内的塔板数相当多，因此即使组分分配系数只有微小差异，仍然可以获得好的分离效果。

理论塔板数（number of theoretical plate）又称理论塔片数，用 n 表示：为完成某一指定分离要求所需理论塔板的数量，即组分流过色谱柱时，在两相间进行平衡分配的总次数。描述色谱柱效能的一项主要指标，当色谱柱长为L时，则它的理论塔板数 n 为： n=L/H   或  H=L/n 当色谱柱长L固定时，n 值越大，或H值越小，柱效率越高，分离能力越强。n 和H可以等效地用来描述柱效率。

高效液相色谱法是以液体作为流动相，并彩用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。 HPLC适于分析分离不挥发和极性物质。对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。

HPLC配有程序控制洗脱溶剂的梯度混合仪，数据处理的积分仪和记录仪等电子系统， 是一种先进的分析仪器，在生物化学、化学、医药学和环境科学的研究中发挥了重要作用。

氨基酸的鉴定、分离纯化（I） 纸层析、薄层层析

纸层析 纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法。它利用不同物质在同一推动剂中具有不同的分配系数，经层析而达到分离的目的。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数。

层析溶剂（又称推动剂），是选用有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲和力（纤维素分子的葡萄糖基上的-OH基与水通过氢键相作用）能吸附很多水分，一般达滤纸重的22％左右（其中约有6％的水与纤维素结合成复合物），由于这部分水扩散作用降低形成固定相；而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动，形成流动相。

层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其上的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。随着有机溶剂不断向前移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的重新分配，同时溶质离开原点不断向前移动，溶质中各组分的分配系数不同，前进中出现了移动速率差异，通过一定时间的层析，不同组分便实现了分离。

氨基酸的鉴定、分离纯化（II） 离子交换层析

HPLC层析系统 泵的结构 HPLC层析系统

实验室用层析柱 工业用层析柱  0.5-5 cm  5-100 cm