第十一章 食品添加剂的测定 主讲人 李协荣 2017/2/25

目 录 第一节 概述 第二节 甜味剂的测定 糖精钠、甜蜜素、甜味素 第三节 防腐剂 目 录 第一节 概述 第二节 甜味剂的测定 糖精钠、甜蜜素、甜味素 第三节 防腐剂 苯甲酸及山梨酸、对羟基苯甲酸酯、丙酸钙、脱氢乙酸、禁用防腐剂 第四节 抗氧化剂 BHA、BHT、PG、 第五节 发色剂 硝酸盐、亚硝酸盐 第六节 漂白剂 亚硫酸盐、过氧化苯甲酰 第七节 着色剂 2017/2/25

第一节 概述 一、食品添加剂的定义与用途 在食品的生产加工过程中，由于某些需要，有意识地向食品中添加少量化学合成物质或天然物质，在食品工艺学上把这些物质称为食品添加剂。 《中华人民共和国食品卫生法》对食品添加剂的定义为“为了改善食品品质和色、香、味以及为满足防腐和加工工艺的需要而加入食品中的化学合成物或者天然物质。” 该法还规定了食品强化剂的定义是“为增强营养成分而加入食品中的天然或人工合顾的属于天然营养范围的食品添加剂”。 2017/2/25

天然食品添加剂主要来自于动、植物组织或微生物的代谢产物。 食品添加剂按其来源分为天然与合成两类： 天然食品添加剂主要来自于动、植物组织或微生物的代谢产物。 人工合成食品添加剂是通过化学手段使元素或化合物发生氧化、还原、缩合、聚合、成盐等一系列化学反应而制成。 食品添加剂种类有： 防腐剂、抗氧化剂、发色剂、漂白剂、酸味剂、凝固剂、疏松剂、增稠剂、消泡剂、甜味剂、着色剂、乳化剂、品质改良剂、抗结剂、酶制剂、香料、营养强化剂、食品加工助剂、增味剂、保鲜剂及其它添加剂等。 2017/2/25

1.经过规定的食品毒理学安全评价程序的评价证明在使用限量内长期使用对人体安全无害。 使用食品添加剂应该遵循以下原则： 1.经过规定的食品毒理学安全评价程序的评价证明在使用限量内长期使用对人体安全无害。 2.不影响食品感官性质和原味，对食品营养成分不应有破坏作用。 3.食品添加剂应有严格的质量标准，其有害杂质不得超过允许限量。 4.不得由于使用食品添加剂而降低良好的加工措施和卫生要求。 5.不得使用食品添加剂掩盖食品的缺陷或作为伪造的手段。 6.未经卫生部允许婴儿及儿童食品不得加入食品添加剂。 2017/2/25

二、食品添加剂的卫生学问题 1.急性和慢性中毒 2.引起变态反应 3.体内蓄积问题 4.食品添加剂的转化问题 2017/2/25

食品添加剂的分析测定一般包括三部分的内容，即： 添加剂本身的测定，以保证其应有的质量标准和安全性，主要有鉴别试验、含量分析、质量指标分析等； 三、食品添加剂的测定 食品添加剂的分析测定一般包括三部分的内容，即： 添加剂本身的测定，以保证其应有的质量标准和安全性，主要有鉴别试验、含量分析、质量指标分析等； 食品中食用添加剂的定性、定量分析； 食品中禁用添加剂的测定。 日常检验中经常遇到的食品添加剂主要有防腐剂、抗氧化剂、着色剂、发色剂、甜味剂等， 测定方法：比色法、紫外分光光度法、薄层色谱法、HPLC法 2017/2/25

食品中常见添加剂的测定 防腐剂的测定 食品中苯甲酸、山梨酸及其盐的测定 食品中对羟基苯甲酸酯的测定 食品中丙酸钠、丙酸钙的测定 食品中脱氢乙酸的测定 禁用防腐剂的检验 抗氧化剂的测定 食品中BHA和BHT的测定 油脂中PG的测定 甜味剂的测定 食品中的糖精钠的分析 食品中环已基氨基磺酸钠的测定 食品中天门冬酰苯丙氨酸甲酯的测定 漂白剂的测定 食品中亚硫酸盐的测定 食品中过氧化苯甲酰的测定 食品中发色剂——亚硝酸盐与硝酸盐含量的分析 食品中着色剂的测定 食品中常见添加剂的测定 2017/2/25

第二节 甜味剂的测定 一、主要甜味剂的性质 甜味剂是赋予食品甜味的添加剂，可分为天然甜味剂和人工合成甜味剂。 第二节 甜味剂的测定 一、主要甜味剂的性质 甜味剂是赋予食品甜味的添加剂，可分为天然甜味剂和人工合成甜味剂。 天然甜味剂中包括蔗糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖等天然糖类和糖的衍生物（如木糖醇、麦芽糖醇等）以及其它天然甜味物（如甜菊糖甙、甘草酸、某些蛋白质等）。 人工合成甜味剂主要是一些具有甜味的化学物质，其甜度一般比蔗糖高数十倍仍至数百倍，但不具有任何营养价值。 我国批准并广泛使用的主要有糖精钠、环已基氨基磺酯钠（甜蜜素）、天门冬酰氨酸甲酯（甜味素）等。 2017/2/25

糖精化学名称为邻-磺酰苯甲酰亚胺其分子式为C7H5O3NS，白色结晶或白色晶状粉末，难溶于水，溶于乙醚、乙醇、氯仿等有机试剂，化学性质不稳定，遇热易分解。 糖精钠为糖精的钠盐，是含有两个水分子的无色或白色结晶，无臭，稍有苦味，在空气中风化失去结晶水后成粉末状。溶于水，不溶于乙醚、乙醇、氯仿等有机试剂，化学性质较为稳定。 2017/2/25

糖精对人体无营养价值，一般认为糖精钠在体内不被利用，大部分由尿排出。 有试验表明，过量摄入糖精钠可导致实验动物肿瘤发生率增大。国际上对糖精钠的利用普遍采取限制态度。美国允许使用在软饮料0.072g/L；冷饮0.150g/L；糖果2.1~2.6g/kg；烘焙食品0.012g/kg。FAO/WHO规定糖精的ADI为2.5mg/kg体重，在膳食治疗中为10mg/kg体重。 2017/2/25

甜蜜素化学名称为环已基氨基磺酸钠，分子式为C6H12NaO3S，结构式为：   甜蜜素纯品为白色结晶粉末，甜度为蔗糖的40-70倍，易溶水，微溶于乙醇，不溶于三氯甲烷、乙醚。摄入体内后，40%由尿排出，其余的由粪便排出。主要供糖尿病患者使用，使用浓度不超过0.4%，FAO/WHO规定ADI为11mg/kg体重。 NH·SO3Na 2017/2/25

二 食品中甜味剂的允许量标准 2017/2/25

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食品中的糖精钠的分析 糖精钠的测定方法较多，国家标准GB/T5009.28-1996中规定了高效液相色谱法、薄层色谱法及离子选择电极法测定食品中糖精钠的标准方法。 另外气相色谱法、比色法、紫外吸收分光光度法、荧光法等方法也常用于测定糖精钠。 应用气相色谱法测定时，样品提取液中的糖精钠需要通过甲基化或三甲基硅烷化处理，然后才能进行气相色谱分离测定。 比色法测定糖精钠是应用糖精钠与苯酚-硫酸在175℃下反应，生成酚磺肽，在碱性条件下生成红色产物的原理进行测定。 2017/2/25

1 原理 样品加温除去二氧化碳和乙醇，调pH至近中性，过滤后进高效液相色谱仪经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量分析。 （一）高效液相色谱法 1 原理 样品加温除去二氧化碳和乙醇，调pH至近中性，过滤后进高效液相色谱仪经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量分析。 　2 试剂 （１）甲醇：经滤膜（0.5μm）过滤 （２）氨水（１＋１）：氨水加等体积的水混合 （３）乙酸铵溶液（0.02mol/L)：称取1.54g乙酸，加水至1000mL溶解，经滤膜（0.45μm）过滤 （４）糖精钠标准储备溶液（1.0mg/mL）：准确称取0.0851g经120℃烘干４小时后的糖精钠，加水溶解定容至1000mL。 （５）糖精钠标准使用溶液（0.1mg/mL）：吸取糖精钠标准储备液10.0mL放入100mL容量瓶中，加水至刻度，经滤膜（0.45μm）过滤。 2017/2/25

称样 加热 调pH 过滤 ３仪器 高效液相色谱仪，紫外检测器 ４分析步骤 （１）样品处理 　　高效液相色谱仪，紫外检测器 ４分析步骤 （１）样品处理 ①汽水：称取5.00~10.00g样品，放入小烧杯中，微温搅拌除去二氧化碳，用氨水(1+1)调pH约为７。加水定容至适当体积，经滤膜（0.45μm）过滤。 ②果汁类：称取5.00~10.00g样品，放入小烧杯中，用氨水(1+1)调pH约为７。加水定容至适当体积，离心沉淀，上清液经滤膜（0.45μm）过滤。 ③配制酒类：称取10.00g样品，放入小烧杯中，水浴加热除去乙醇，用氨水(1+1)调pH约为７。加水定容至适当体积，经滤膜（0.45μm）过滤。 称样 加热 调pH 过滤 2017/2/25

色谱柱：YWG-C18 4.6mm×250mm 10μm不锈钢柱。 流动相：甲醇：乙酸铵溶液(0.02mol/L) (5+95)。 （２）高效液相色谱条件 　　色谱柱：YWG-C18 4.6mm×250mm 10μm不锈钢柱。 　　流动相：甲醇：乙酸铵溶液(0.02mol/L) (5+95)。 　　流速：1mL/min 检测器：紫外检测器，波长230nm，灵敏度0.2AUFS （３）测定 　　取样品处理液和标准使用液各10μL（或相同体积）注入高效液相色谱仪进行分离测定，根据峰保留时间定性，峰面积定量。 2017/2/25

（４）计算 式中: Ｘ1——样品中糖精钠含量，g/kg； m1——进样体积中糖精钠的质量，mg； V1——样品稀释液总体积，mL； 结果表达：报告算术平均数的三位小数。 允许相对相差小于10%. 2017/2/25

１ 原理 在酸性条件下，食品中的糖精钠用乙醚提取、浓缩、薄层色谱分离，显色后与标准比较，进行定性和半定量分析。 （二）薄层色谱法 １ 原理　在酸性条件下，食品中的糖精钠用乙醚提取、浓缩、薄层色谱分离，显色后与标准比较，进行定性和半定量分析。 ２ 试剂 (1)乙醚：不含过氧化物。 (2)无水硫酸钠 (3)无水乙醇及95%乙醇 (4)聚酰胺粉：200目 (5)盐酸（1+1）：取100mL盐酸加水稀释至200mL。 (6)展开剂：正丁醇＋氨水＋无水乙醇(7+1+2)，异丙酮＋氨水＋无水乙醇(7+1+2)　 (7)显色剂：溴甲酚紫溶液(0.4g/L)　称取0.04g溴甲酚紫，用95%乙醇溶解，加氢氧化钠溶液(4g/L)1.1mL调节pH为８，定容至100mL。 2017/2/25

(1)玻璃纸：生物制品透析袋或不含增白剂的市售玻璃纸。 (2)玻璃喷雾器 (3)微量注射器 (4)紫外灯：波长253.7nm (8)硫酸铜溶液(100g/L) (9)氢氧化钠溶液(40g/L)。 (10)糖精钠标准溶液：准确称取0.0851g经120℃烘干４小时后的糖精钠，加乙醇溶解，移入100mL容量瓶中，加95%乙醇稀释至刻度。此溶液每毫升相当于1mg糖精钠（C6H4CONNaSO2·2H2O）。 3 仪器 (1)玻璃纸：生物制品透析袋或不含增白剂的市售玻璃纸。 (2)玻璃喷雾器 (3)微量注射器 (4)紫外灯：波长253.7nm (5)薄层板：10cm×20cm 或20cm×20cm (6)展开槽 2017/2/25

4 分析步骤 　　(1)样品提取 　　①饮料、冰棍、汽水：取10mL均匀试样（如样品中含有二氧化碳，先加热除去，如样品中含有酒精，加4%氢氧化钠溶液使其呈碱性，在沸水浴中加热除去）置于100mL分液漏斗中，加2mL盐酸(1+1)，用30,20,20mL乙醚提取３次，合并提取液，用5mL盐酸酸化的水洗涤一次，弃去水层，乙醚层通过无水硫酸钠脱水后，挥干乙醚，加2.0mL乙醇溶解残留物，密塞保存，备用。 ②酱油、果汁、果酱等：称取20.0g磨碎的均匀试样，置于100ml容量瓶中，加水至约60ml，加20ml硫酸铜溶液（100g/L），混匀，再加4.4ml氢氧化钠溶液（40/L），加水至刻度，混匀，静置30min，过滤，取50ml滤液置于250ml分液漏斗中，以下按①自“加2ml盐酸（1+1）……”操作。 2017/2/25

③固体果汁粉等：称取20.0g磨碎的均匀试样，置于200ml容量瓶中，加100ml水，加温使之溶解、放冷，以下按②自“加20ml硫酸铜溶液（100g/L）……”操作。 ④糕点、饼干等蛋白质、脂肪、淀粉含量高的样品：称取25.0g均匀试样，置于透析用玻璃纸中，放入大小适当的烧杯中，加50ml氢氧化钠溶液（0.8g/L）调成糊状，将玻璃纸口扎紧，放入盛有200ml氢氧化钠溶液（0.8g/L）的烧杯中，盖上表面皿，透析过夜。量取125ml透析液（相当于12.5g样品），加约0.4ml盐酸（1+1）使成中性，加20ml硫酸铜溶液（100g/L），混匀，再加4.4ml氢氧化钠溶液（40g/L），混匀，静置30min，过滤。取120ml（相当于10g样品），置于250ml分液漏斗中，以下按①自“加2ml盐酸（1+1）……”操作。 2017/2/25

（2）薄层板的制备 称取1. 6g聚酰胺粉，加0. 4g可溶性淀粉，加约7. 0mL水，研磨3~5min，立即涂成0. 25~0 （2）薄层板的制备 称取1.6g聚酰胺粉，加0.4g可溶性淀粉，加约7.0mL水，研磨3~5min，立即涂成0.25~0.30mm厚的10cm×20cm的薄层板，室温干燥后，在80℃下干燥1h。置于干燥器中保存。 （3）点样 在薄层板下端2cm处，用微量注射器点10mL和20mL的样液二个点，同时点3.0,5.0,7.0,10.0mL糖精钠标准溶液，各点间距1.5cm。 （4）展开与显色 将点好的薄层析放入盛有展开剂的展开槽中，展开剂液层约0.5cm，并预先已达到饱和状态。展开至10cm，取出薄层板，挥干，喷显色剂，斑点显黄色，根据样品点和标准定性，根据斑点颜色深浅进行半定量。 2017/2/25

X2——样品中糖精钠的含量，g/kg或g/L； m3——测定用样液中糖精钠的质量，mg； V4——点板样液质量（体积），g或ml； 5 计算   式中： X2——样品中糖精钠的含量，g/kg或g/L； m3——测定用样液中糖精钠的质量，mg； V4——点板样液质量（体积），g或ml； V3——样品提取液残留物加入乙醇的体积，mL;　　M4——样品质量，g 2017/2/25

(三)离子选择电极测定法 1. 原理 糖精选择电极是以季铵盐所制薄膜为感应膜的电极，它和作为参比电极的饱和甘汞电极配合使用以测定食品中糖精钠的含量。当测定温度、溶液总离子强度和溶液接界电位电位条件一致时，测得的电位遵守能斯特方程式电位差随溶液中糖精钠离子的活度（或浓度）改变而变化。 被测溶液中糖精钠含量在0.02~1mg/ml范围内。电极电位值与糖精离子浓度负对数成直线关系。 样品提取 转移蒸干 溶解 测电位 比较定量 2017/2/25

（1）乙醚：使用前用盐酸（6mol/L）饱和。 （2）无水硫酸钠 （3）盐酸（6mol/L） 2. 试剂 （1）乙醚：使用前用盐酸（6mol/L）饱和。 （2）无水硫酸钠 （3）盐酸（6mol/L） （4）氢氧化钠溶液：0.06mol/L、0 .02mol/L、 40g/L （5）硫酸铜溶液（100g/L） （6）磷酸二氢钠[c(NaH2PO4·2H2O)=1mol/L]溶液 （7） 磷酸氢二钠[c(Na2HPO4·12H2O)=1mol/L]溶液 （8）总离子强度调节缓冲液：87.7ml磷酸二氢钠溶液（1mol/L）和12.3ml 磷酸氢二钠溶液（1mol/L）混合。 （9）糖精钠标准溶液：准确称取0.0851g经120℃烘干４小时后的糖精钠结晶，移入100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。此溶液每毫升相当于1mg糖精钠。 2017/2/25

精密级酸度计或离子活度计或其它精密级电位仪，准确至±1mV。 糖精选择电极。 3 仪器 精密级酸度计或离子活度计或其它精密级电位仪，准确至±1mV。 糖精选择电极。 217型甘汞电极：具双盐桥式甘汞电极，下面的盐桥内装入含1%琼脂的氯化钾溶液（3mol/L）。 磁力搅拌器 透析用玻璃纸。 2017/2/25

在半对数纸上以毫升(毫克)为纵坐标；电位值(-mV)为横坐标绘制标准曲线。 4.测定步骤 样品提取 提取方法同前法 测定 ①标准曲线的绘制：准确吸取0，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0mL糖精钠标准溶液(相当于0，0.5，1.0，2.5，5.0，10.0mg糖精钠)，分别置于50ml容量瓶中，各加5mL总离子强度调节缓冲液，加水至刻度，摇匀。 将糖精选择电极和甘汞电极分别与测量仪器的负端和正端相连接，将电极插入盛有水的烧杯中，按其仪器的使用说明书调节至使用状态，在搅拌下用水洗至电极起始电位(例如某些电极起始电位达-320mV)。取出电极用滤纸吸干。将上述标准系列溶液按低浓度到高浓度逐个测定，得其在搅拌时的平衡电位值(-mV)。 在半对数纸上以毫升(毫克)为纵坐标；电位值(-mV)为横坐标绘制标准曲线。 2017/2/25

式中：X：——样品中糖精钠的含量，g／kg或g/L； m5——测定液中糖精钠的质量，mg6 V5——乙醚提取液的体积，m山 ②样品的测定：准确吸取20mL乙醚提取液置于50mL烧杯中，挥发至干残渣，加5mL总离子强度调节缓冲液。小心转动，振摇烧杯使残渣溶解，将烧杯内容物全部定量转移入50mL容量瓶中，原烧杯用少量水多次漂洗后，并入容量瓶中，最后加水至刻度摇匀。依法测定其电位值(-mV),，查标准曲线求得测定液中糖精钠毫克数。 计算 m5× 1000 X3= —————————— m6 ×(V6/V5)×1000 式中：X：——样品中糖精钠的含量，g／kg或g/L； m5——测定液中糖精钠的质量，mg6 V5——乙醚提取液的体积，m山 V6——分取乙醚提取液的体积，mL； m6——样品的质量或体积，g或mL。 2017/2/25

食品中环已基氨基磺酸钠的测定 GB13112-91规定了气相色谱法、比色法、薄层色谱法测定食品中环已基氨基磺酸钠的测定方法。其中气相色谱法及比色法适用于饮料、凉果等食品中环已基氨基磺酸钠的测定，薄层层析法适用于饮料、果汁、果酱、糕点中环已基氨基磺酸钠的测定。 （一） 气相色谱法 本方法适用于饮料、凉果等食品中环已基氨基磺酸钠的测定。 1 原理 在硫酸介质中环己基氨基磺酸钠与亚硝酸反应，生成环己醇亚硝酸酯，利用气相色谱法进行定性和定量。 试样制备 提取 反应 GC分析 比较定量 标准系列 GC分析 2017/2/25

（1）正己烷 （2）氯化钠。（3）层析硅胶(或海砂)。 （4）50g／L亚硝酸钠溶液。 （5）100g／L硫酸溶液。 2 试剂 （1）正己烷 （2）氯化钠。（3）层析硅胶(或海砂)。 （4）50g／L亚硝酸钠溶液。 （5）100g／L硫酸溶液。 （6）环己基氨基磺酸钠标准溶液：精确称取1.0000g环己基氨基磺酸钠，加水溶解并定容至100mL，此溶液每毫升含环己基氨基磺酸钠10mg。 2017/2/25

①液体试样：称取20.0g试样于100mL带塞比色管，置冰浴中。 3 仪器 （1）气相色谱仪附氢火焰离子化检测器。 （2）旋涡混合器。 （3）离心机。 （4）微量注射器。 4 分析步骤 （1）试料制备 ①液体试样：称取20.0g试样于100mL带塞比色管，置冰浴中。 ②固体试样：称取2.0g已剪碎的试样于研钵中，加少许层析硅胶(或海砂)研磨至呈干粉状，经漏斗倒入100mL容量瓶中，加水冲洗研钵，并将洗液一并转移至容量瓶中，加水至刻度，不时摇动，1h后过滤，即得试料，准确吸取20mL于100mL带塞比色管，置冰浴中。 2017/2/25

①色谱柱：长2m，内径3mm，U形不锈钢柱。 固定相：Chromosorb W AW DMCS 80—100目，涂以10％SE—30。 （2）色谱条件 ①色谱柱：长2m，内径3mm，U形不锈钢柱。 固定相：Chromosorb W AW DMCS 80—100目，涂以10％SE—30。 ②测定条件 柱温：80℃；汽化温度：150℃；检测温度：150℃。 （3）测定 ①标准曲线的制备：准确吸取1.00mL环己基氨基磺酸钠标准溶液于100mL带塞比色管中，加水20mL，置冰浴中，加入5mL 50g/L亚硝酸钠溶液，5mL 100g/L硫酸溶液，摇匀，在冰浴中放置30min，并经常摇动，然后准确加入10mL正己烷，5g氯化钠，摇匀后置旋涡混合器上振动1min(或振摇80次)，待静止分层后吸出己烷层于10mL带塞离心管中进行离心分离，每毫升己烷提取液相当1mg环己基氨基磺酸钠，将标准提取液进样l~5ΜL于气相色谱仪中，根据响应值绘制标准曲线。 2017/2/25

②样品管按①自“加入5mL 50g/L亚硝酸钠溶液……”起依法操作，然后将试料同样进样l~5mL，测得响应值，从标准线图中查出相应含量。 5计算 式中：X——样品中环己基氨基磺酸钠的含量，g／kg； m——样品质量，g； V——进样体积，μL； 10——正己烷加入量，mL， A——测定用试料中环己基氨基磺酸钠的含量，μg。 两次平行测定相对允许误差绝对值≤10％，平行测定结果用算术平均值表示，保留二位小数。 X= A×10×1000 m×V×1000 = 10×A m ×V 2017/2/25

本方法适用于饮料、凉果等样品中环已基氨基磺酸钠的测定。 （一）   比色法 本方法适用于饮料、凉果等样品中环已基氨基磺酸钠的测定。 1 原理 在硫酸介质中环己基氨基磺酸钠与亚硝酸钠反应，生成环己醇亚硝酸酯，与磺胺重氮化后再与盐酸萘乙二胺偶合生成红色染料，在550nm波长测其吸光度，与标准比较定量。 2 试剂 （1）三氯甲烷。 （2）甲醇。 （3）透析剂：称取0．5g二氯化汞和12．5g氯化钠于烧杯中，以0．01mol儿盐酸溶液定容至100mL。 （4）10g／L亚硝酸钠溶液。（5）100g/L硫酸溶液。 2017/2/25

（6）100g/L尿素溶液(临用时新配或冰箱保存)。 （7）100g/L盐酸溶液 （8）10g/L磺胺溶液：称取1g磺胺溶于10％盐酸溶液中，最后定容至100mL （9）1g/L盐酸萘乙二胺溶液 （10）环己基氨基磺酸钠标准溶液：精确称取0.1000g环己基氨基磺酸钠，加水溶解最后定容至100mL, 此溶液每毫升含环己基氨基磺酸钠1mg。 临用时将环己基氨基磺酸钠标准溶液稀释10倍。此液每毫升含环己基氨基磺酸钠0.1mg。 3 仪器 （1）分光光度计。 （2）旋涡混合器。 （3）离心机。 （4）透析纸。 2017/2/25

②固体试料：准确吸取10.0mL经上述处理后的试料提取液于透析纸中，以下操作按①项下进行。 4 分析步骤 （1）试样处理 同气相色谱法。 （2）提取 ①液体试料：称取10.0g试料于透析纸中，加10mL透析剂，将透析纸口扎紧，放入盛有100mL水的200mL广口瓶内，加盖，透析20—24h得透析液。 ②固体试料：准确吸取10.0mL经上述处理后的试料提取液于透析纸中，以下操作按①项下进行。 2017/2/25

②另取2支50mL带塞比色管，分别加入10mL水和10mL透析液，除不加10g／L亚硝酸钠外，其他按①项下进行，测得吸光度As0及A0 。 （3）测定 ①取2支50mI—带塞比色管，分别加入10mL透析液和10mL标准液，于0~3℃冰浴中，加入1mL l0g/L亚硝酸钠溶液，1mL 100g/L硫酸溶液，摇匀后放入冰水中不时摇动，放置1h，取出后加15mL三氯甲烷，置旋涡混合器上振动1min，静置后吸去上层液，再加15mL水，振动1min，静止后吸去上层液，加10mL l00g/L尿素溶液，2mL l00g/L盐酸溶液，再振动5min，静置后吸去上层液，加15mL水，振动lmin，静置后吸去上层液，分别准确吸出5mL三氯甲烷于2支25mL比色管中。另取一支25mL比色管加入5mL三氯甲烷作参比管。 于各管中加入15mL甲醇，1mL 10g／L磺胺，置冰水中15min，取出回复常温后加入1mL 1g/L盐酸萘乙二胺溶液，加甲醇至刻度，在15~30℃下放置20~30min，用1cm比色杯于波长550nm处测定吸光度，测得吸光度A及As。 ②另取2支50mL带塞比色管，分别加入10mL水和10mL透析液，除不加10g／L亚硝酸钠外，其他按①项下进行，测得吸光度As0及A0 。 2017/2/25

X= —— × ———— × ———— × —— × —— m As-As0 V 1000 1000 5计算 C A-A0 100+10 1 1000 X= —— × ———— × ———— × —— × —— m As-As0 V 1000 1000 式中：X——样品中环己基氨基磺酸钠的含量，g／kg； m——样品质量，g； V——透析液用量，mL； C——标准管浓度，μg／mL； As——标准液吸光度； As0——水的吸光度； A——试料透析液吸光度； A0——不加亚硝酸钠的试料透析液吸光度。 两次平行测定相对允许误差绝对值＜10％，平行测定结果用算术平均值表示，保留二位小数。 2017/2/25

食品中天门冬酰苯丙氨酸甲酯的测定 目前无测定食品中天门冬酰苯丙氨酸甲酯的标准方法。但有高效液相色谱法测定饮料中天门冬酰苯丙氨酸甲酯的报导。 1．原理 样品经加温除去二氧化碳，经微孔滤膜过滤后直接注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和蜂面积进行定性定量。 2．试剂 (1)甲醇。 (2)氢氧化铵。 (3)天门冬酰苯丙氨酸甲酯。 (4)天门冬酰苯丙氨酸甲酯标准溶液：称取天门冬酰苯丙氨酸甲酯0.0250g，用移动相溶解并稀释至50mL，混匀后，通过0.45μm微孔滤膜脱气。 2017/2/25

(1)样品处理：饮料先微温赶气，然后经过0.45μm的微孔滤膜过滤。 (2)样品测定 a．色谱条件： 3．仪器 岛津LC-4A高效液相色谱仪 紫外检测器、超声波清洗器等。 4．操作方法 (1)样品处理：饮料先微温赶气，然后经过0.45μm的微孔滤膜过滤。 (2)样品测定 a．色谱条件： 流动相：甲醇200mL+水250mL+氨(1+99)0.7mL+硫酸(1+4) l mL，调混合液pH为4~4.5，使用前通过0.45μm微孔滤膜脱气或超声脱气。流速：1mL／min， 色谱柱：EorbaxC18，4.6mm×250mm，粒度为10μm。 检测器：λ＝214nm；灵敏度：0.08AUFS。 柱温：40℃ 2017/2/25

式中：X——每升饮料中含有天门冬酰苯丙氨酸甲酯量,g/L； A——由标准曲线查得的测定液中相当于天门冬酰-苯丙氨酸甲酯量，μg； b．制备标准曲线：分别进天门冬酰苯丙氨酸甲酯标准液2,4,10,20μL(即相当于天门冬酰苯丙氨酸甲酯1,2,5,10μg)，每个浓度连续测定3次，取其峰面积平均值。以峰面积为纵坐标、天门冬酰苯丙氨酸甲酯量(μg)为横坐标作曲线。 c．样品进样20μL，与标准同样条件进行测定，测得样品中天门冬酰苯丙氨酸甲酯的峰面积，然后从标准曲线上查得测定液中所含天门冬酰苯丙氨酸甲酯的量。 5．计算 　 A×1000×1000 X= ————————— 　 V×1000×1000 式中：X——每升饮料中含有天门冬酰苯丙氨酸甲酯量,g/L； A——由标准曲线查得的测定液中相当于天门冬酰-苯丙氨酸甲酯量，μg； V——测定时进样的体积，μL。 2017/2/25

第三节 防腐剂的测定 防腐剂是能防止由微生物作用引起食品腐败变质、延长食品保存期的一种食品添加剂，它还有防止食物中毒的作用。在GB2760中允许使用的防腐剂适用范围一般只限于蛋白质含量较低有食品。 我国允许使用的防腐剂品种分为无机防腐剂和有机防腐剂两类，有机防腐剂主要有苯甲酸（及其钠盐）、山梨酸（及其钾盐）、对羟基苯甲酸丙酯、乳酸及醋酸、脱氢乙酸和乙酸衍生物、丙酸、2-（4-噻唑）-苯并咪唑（TBZ）、低级脂肪酸甘油酯、氨基酸、维生素等，无机防腐剂主要有硝酸盐和亚硝酸盐、亚硫酸及其盐类、游离氯与次氯酸盐、二氧化碳等。 2017/2/25

允许使用的防腐剂中使用其钠盐或钾盐的主要原因一般是为了提高其溶解度。这些防腐剂的毒性都较低，苯甲酸、山梨酸等由于代谢过程参与体内现有的代谢渠道，因此毒性很低。有些防腐剂还有其它用途，如亚硫酸及其盐类常用作漂白剂；硝酸盐与亚硝酸盐主要用作肉类制品腌制时的发色剂，国外使用山梨酸、山梨酸钾代替发色剂亚硝酸盐，既防止肉毒梭菌芽孢的发育又降低亚硝酸盐的含量。 2017/2/25

苯甲酸对大白鼠LD50为2700mg/kg（经口服）。以1%浓度加入饲料中饲喂大鼠，对生长、生殖无不良影响。 一、主要防腐剂的性质与毒性 苯甲酸及其钠盐（Benzoic acid & sodium salt ）是我国及其世界各国最普遍使用的防腐剂之一。具有成本低廉、供应充足、毒性较低的优点。在酸性（pH<4）食品中作用效果较好。 苯甲酸为白色叶状或针状结晶，溶点122.4℃，化学性质较为稳定。微带安息香及苯甲醛气味，无臭味，在空气中微有挥发性，水溶液呈酸性，由于其在在水中溶解度较低，实际生产中多用其钠盐。苯甲酸钠使用量超过0.1%时可尝出其味道。 苯甲酸对大白鼠LD50为2700mg/kg（经口服）。以1%浓度加入饲料中饲喂大鼠，对生长、生殖无不良影响。 人体每日体内可合成0.7-1.7克苯甲酸，并与甘氨酸结合转为马尿酸，由体内排出。WHO规定人体每日允许摄入量（ADI,acceptable daily intake）为5mg/kg体重。 2017/2/25

山梨酸及其钾盐（Sorbic acid & sorbate potassium）也是世界各国最普遍使用的防腐剂。 山梨酸（结构式为CH3CH=CHCH=CHCOOH）的化学名称为已二烯-（2，4）-酸，是一种不饱和脂肪酸，为无色针状结晶或白色结晶粉末，无臭味，稍有刺激性，溶于水及乙醇等有机试剂，对光、热稳定。钾盐为白色或淡黄色鳞片状结晶，易溶于水、乙醇，空气中吸湿易氧化分解。 山梨酸在机体可正常参加代谢，最后分解成二氧化碳和水，几乎无毒，因此山梨酸和山梨酸钾是迄今为止毒性最低的防腐剂。毒理学试验表明，山梨酸对大白鼠LD50为7400-10500mg/kg（经口服）。以5%浓度加入饲料中饲喂大鼠，对生长、生殖、存活率、消化等无不良影响。WHO建议人体每日允许摄入量为25mg/kg体重。 2017/2/25

纯品为无色或白色结晶粉末，无臭或有轻微的特殊香气，味微苦，灼麻。对光、热稳定，无吸湿性，微溶于水，溶于乙醇等溶剂。 对羟基苯酸酯类（ethye P-hy-droxybenzoate）包括其乙酯、丙酯和丁酯，以及对羟基苯甲酸异丁酯、异丙酯。对羟基苯甲酸乙酯（又名尼泊金乙酯，分子式为C9H10O3）的结构式为：      纯品为无色或白色结晶粉末，无臭或有轻微的特殊香气，味微苦，灼麻。对光、热稳定，无吸湿性，微溶于水，溶于乙醇等溶剂。 对羟基苯甲酸丙酯（又名尼泊金丙酯，分子式为C10H12O3）纯品性质与对羟基苯甲酸乙酯相似。 对羟基苯甲酸酯类的抗菌作用比苯甲酸和山梨酸强，对细菌特别是革兰氏阴性菌效果较差，但比苯甲酸效果好，适用的pH范围为4-8。其作用主要在于抑制微生物细胞的呼吸酶系和电子传递酶系的活性，以及破坏微生物的细胞膜结构。其ADI为10mg/kg。 HO— —COOC2H5 2017/2/25

另外，因毒性较高等原因，我国禁止使用甲醛、硼酸、硼砂、水杨酸、β-萘酚等防腐剂。 丙酸（CH3CH2COOH）及丙酸盐（CH3CH2COONa）也是酸型防腐剂，其对霉菌、好气芽胞产生菌、革兰氏阴性菌有效。对酵母无效，特别是对使面包生成丝状粘质的细菌有效，其毒性极低，可认为是食品的正常成分，是各国广泛用于面包、糕点及发酵制品的防霉防腐剂。在防霉的同时也可防止产生黄曲霉毒素。 另外，因毒性较高等原因，我国禁止使用甲醛、硼酸、硼砂、水杨酸、β-萘酚等防腐剂。 2017/2/25

（一）我国食品防腐剂使用量标准（GB2760-1996） 二、食品防腐剂使用量标准 （一）我国食品防腐剂使用量标准（GB2760-1996） 名称 使用范围 最大使用量（g/kg) 备注 苯甲酸、 苯甲酸钠 酱油、醋、果汁（味）型饮料、果酱（不包含罐头） 1.0 苯甲酸和苯甲酸钠同时使用时，以苯甲酸计，不得超过最大允许使用量；以苯甲酸计，塑料桶装浓缩果蔬汁不得超过2g/kg 葡萄酒、果子酒、琼脂软糖 0.8 碳酸饮料 0.2 低盐酱菜、酱类、蜜饯 0.5 食品工业用塑料桶装浓缩果蔬汁 2.0 山梨酸、 山梨酸钾 酱油、食醋、果酱、氢化植物油、软糖、鱼干制品、即食豆制食品、糕点、馅、面包、蛋糕、月饼、即食海蜇、乳酸菌饮料 以山梨酸计，食品工业用塑料桶装浓缩果蔬汁不得超过2g/kg；山梨酸和山梨酸钾同时使用时，以山梨酸计，不得超过最大允许使用量 低盐酱菜、酱类、蜜饯、果汁（味）型饮料、果冻、胶原蛋白肠衣 葡萄酒、果酒 0.6 果、蔬保鲜、碳酸饮料 肉、鱼、蛋、禽制品 0.075 2017/2/25

酱油、酱料、果汁（味）型饮料、果酱（不包含罐头） 0.25 以对羟基苯甲酸计 对于糕点馅，为单一或混合总量 食醋 0.10 名称 使用范围 最大使用量（g/kg) 备注 对羟基苯甲酸乙酯 对羟基苯甲酸丙酯 酱油、酱料、果汁（味）型饮料、果酱（不包含罐头） 0.25 以对羟基苯甲酸计 对于糕点馅，为单一或混合总量 食醋 0.10 糕点 0.5 果蔬保鲜 0.012 碳酸饮料、蛋黄馅 0.20 丙酸钙 面包、醋、酱油、糕点、豆制食品 2.5 以丙酸计。生面制品指切面、馄钝皮 生面湿制品 丙酸钠 应用时使用3%~5%的水溶液，加工前必须洗净 杨梅罐头加工 50 酱油   醋 脱氢乙酸 腐乳、酱菜、原汁桔浆 0.30 2017/2/25

（二）WHO允许摄入防腐剂的ADI值 名称 ADI，mg/kg体重 苯甲酸 山梨酸 对羟基苯甲酸乙酯 对羟基苯甲酸丙酯 丙酸钙、丙酸钠 0~5 0~25 0~10 不作规定 2017/2/25

食品中苯甲酸、山梨酸及其盐的测定 苯甲酸、山梨酸及其盐的分析方法主要有滴定法、紫外吸收法、比色法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。GB/T5009.29-1996规定的方法主要是采用气相色谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法。滴定法用于测定山梨酸、苯甲酸及其盐时，采用酸碱中和滴定原理，样品中加入氯化钠饱和溶液，在酸性条件下用乙醚提取，回收乙醚后用中性乙醇溶解，然后用碱标准溶液滴定；样品中山梨酸、苯甲酸经分离、提取、纯化后，也可利用其化学结构特性采用紫外吸收光谱法进行测定。 2017/2/25

本方法适用于果汁、果酱、酱油、醋中苯甲酸（钠）、山梨酸（钾）的测定，方法简便、快速，是目前应用较多的方法。 （一）气相色谱分析法 本方法适用于果汁、果酱、酱油、醋中苯甲酸（钠）、山梨酸（钾）的测定，方法简便、快速，是目前应用较多的方法。 1 原理 样品经盐酸酸化，以乙醚提取并浓缩，用石油醚：乙醚混合溶液定容，通过附氢火焰离子化检测器的气相色谱仪进行分离测定，与标准系列比较进行定量。 2 试剂 （1）乙醚：不含过氧化物 （2）石油醚：沸程30-60℃ （3）盐酸 （4）无水硫酸钠 （5）盐酸（1+1） （6）氯化钠酸性溶液（40g/L） （7）山梨酸、苯甲酸混合标准溶液：准确称取山梨酸、苯甲酸各0.2000g置于100mL容量瓶中，用石油醚-乙醚（3+1）混合溶剂溶解后并稀释刻度。此溶液每毫升相当于2.0mL山梨酸和苯甲酸。 （8）山梨酸、苯甲酸标准使用液：吸取适量的山梨酸、苯甲酸标准溶液，以石油醚-乙醚（3+1）混合溶剂稀释至每毫升相当于50,100,150,200,250mg山梨酸或苯甲酸。 2017/2/25

3 仪器 气相色谱仪附氢火焰离子化检测器 4 分析步骤 （1）样品提取 3 仪器 气相色谱仪附氢火焰离子化检测器 4 分析步骤 （1）样品提取 称取2.50g预先混合均匀的样品，置于25mL带塞量筒中，加0.5mL盐酸（1+1）酸化，用15mL,10mL乙醚提取两次，每次振摇1min，将上层乙醚提取液吸入另一带塞量筒中。合并乙醚提取液用3mL氯化钠酸性溶液洗涤两次，静止15min，用滴管将乙醚层通过无水硫酸钠滤入25mL容量瓶中。加乙醚至刻度，混匀。准确吸取5mL乙醚提取液于5mL带塞试管中，置40℃水浴上挥干，加入2mL 石油醚-乙醚（3+1）混合溶剂溶解残渣打，备用。 2017/2/25

色谱柱：3mm×2m 玻璃柱，内填充5%DEGS+1%磷酸/Chromosorb W,AW,DMCS,60目。 检测器：氢火焰离子化检测器 （2）色谱参考条件 色谱柱：3mm×2m 玻璃柱，内填充5%DEGS+1%磷酸/Chromosorb W,AW,DMCS,60目。 检测器：氢火焰离子化检测器 温度：柱温 170℃；进样品温度 230℃；检测器温度 230℃ 气体流速：载气（氮气）50mL/min, 氢气 0.9kg/cm2，空气 1.3kg/cm2（气体比例按各仪器型号不同选择各自的最佳比例条件） （3）测定 进样2μL标准系列中各浓度标准使用液于气相色谱仪中，测定各浓度山梨酸、苯甲酸的峰高，以浓度为横坐标，相应的峰高为纵坐标，绘制标准曲线。 同时进样2μL样品溶液。测得峰高与标准曲线比较定量。 2017/2/25

2017/2/25

式中： X1 ——样品中山梨酸或苯甲酸的含量，g/kg； m1 ——测定用样品液中山梨酸或苯甲酸的质量，μg； 5 计算   式中： X1 ——样品中山梨酸或苯甲酸的含量，g/kg； m1 ——测定用样品液中山梨酸或苯甲酸的质量，μg； V1 ——加入石油醚-乙醚（3+1）混合溶剂的体积，mL V2 ——测定时进样的体积，mL m2 ——样品的质量，g； 5 ——测定时吸取乙醚提取液的体积，mL 25 ——样品乙醚提取液的总体积，mL 由测得苯甲酸的量乘以1.18，即为样品中苯甲酸钠的含量。 测定结果取算术平均值的二位有效数字，允许相对相差≤10% 2017/2/25

1 原理 样品加温除去二氧化碳和乙醇，调节pH至中性，过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量分析。 （二）高效液相色谱法 1 原理 样品加温除去二氧化碳和乙醇，调节pH至中性，过滤后进高效液相色谱仪，经反相色谱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性和定量分析。 2 试剂 本方法中所用试剂，除另有规定外，均为分析试剂，水为蒸馏水或同等纯度水，溶液为水溶液。 （1）甲醇：经滤膜（FH0.5μm）过滤 （2）稀氨水（1+1）：氨水加水等体积混合。 （3）乙酸铵溶液（0.02mol/L）：称取1.54g乙酸铵，加水至1000mL，溶解，经滤膜（HA0.45μm ）过滤。 （4）碳酸氢钠溶液（20g/L）：称取2g碳酸氢钠（优级纯），加水至100mL，振摇溶解。 2017/2/25

（5）苯甲酸标准贮备液：准确称取0.1000g苯甲酸，加碳酸氢钠溶液5mL，加热溶解，移入100mL容量瓶中，加水定容至100mL，此溶液每毫升含苯甲酸1mg。 （7）苯甲酸、山梨酸混合标准使用液：取苯甲酸、山梨酸标准贮备液各10.0mL，放入100mL容量瓶中，加水至刻度。此溶液每毫升含苯甲酸、山梨酸各0.1mg。经滤膜（HA0.45μm）过滤后备用（同时测定糖精钠时可加糖精钠标准液）。 3 仪器 高效液相色谱仪（带紫外检测器） 2017/2/25

4 分析步骤 （1）样品处理 汽水：称取5.00~10.0g样品，放入小烧杯中，微温搅拌除去二氧化碳，用氨水（1+1）调pH至7左右。加水定容至1-~20mL,经滤膜 （HA0.45μm）过滤。 果汁类：称取5.00-10.0g样品，用氨水（1+1）调pH至约7，加水定容光焕发至适当体积，离心沉淀，上清液经滤膜（HA0.45μm）过滤。 配制酒类：称取10.0g样品，放入小烧杯内，水浴加热除去乙醇，用氨水（1+1）调pH至约7，加水定容光焕发至适当体积，上清液经滤膜（HA0.45μm）过滤。 2017/2/25

流动相：甲醇：0.02mol/l乙酸铵溶液（5：95）或磷酸氢二钾和磷二氢钾各30克以水溶解并定容到1000mL，流速1mL/min （2）高效液相色谱参考条件： 流动相：甲醇：0.02mol/l乙酸铵溶液（5：95）或磷酸氢二钾和磷二氢钾各30克以水溶解并定容到1000mL，流速1mL/min 色谱柱：4.6mm×25cm不锈钢柱，10μm的YWG-C18固定相 紫外检测器：230nm 进样量：10μL （3）测定 分别进标准溶液和样品溶液，绘制色谱图，根据保留时间定性，应用外标法根据峰面积大小定量。 2017/2/25

式中：X1——样品中山梨酸或苯甲酸的含量，g/kg； 5 计算     式中：X1——样品中山梨酸或苯甲酸的含量，g/kg； m1——进样体积中山梨酸或苯甲酸的质量，mg； V1——样品稀释液总体积，mL V2——测定时进样的体积，mL m2——样品的质量，g； 2017/2/25

食品中对羟基苯甲酸酯的测定 对羟基苯甲酸酯的测定可采用紫外分光光度法、比色法、气相色谱法等。 紫外吸收法是根据对羟基苯甲酸酯在250nm左右有最大吸收的特点，将样品中的对羟基苯甲酸酯类物质提取、分离后，在紫外吸收分光光度计上测定其特征吸收曲线及最大吸收峰（250nm左右）处的吸光度，与标准比较定量。 比色法则是利用对羟基苯甲酸酯类与硝酸汞作用发生颜色反应的特性，将样品中的待测物质经提取、净化后，显色、比色分析。 2017/2/25

食品中丙酯钠、丙酸钙的测定 2017/2/25

食品中脱氢乙酸的测定 2017/2/25

禁用防腐剂的检验 （一）硼酸、硼砂 （二）水杨酸的测定 （三）甲醛 2017/2/25

第四节 抗氧化剂的测定 能阻止或延迟食品氧化，以提高食品稳定性，延长食品安全储藏期限的食品添加剂称为抗氧化剂。 按其溶解性能，抗氧化剂可分为油溶性的和水溶性的两类；按来源可分为天然的和合成的两类。 我国允许使用的油溶性抗氧化剂主要有： 丁基羟基茴香醚（BHA） 二丁基羟基甲苯（BHT） 没食子酸丙酯（PG） 叔丁基-对苯二酚（TBHQ） 2，4，5-三羟基苯丁酮（THBP） 乙氧喹（EMQ） 以及混合生育酚（VE）、愈创树脂（GR）、卵磷脂等 2017/2/25

除了有抗氧化作用外，还用于食品的护色、保持风味等。 一、主要抗氧化剂的性质与毒性 1、BHT （C15 H 24O ） 水溶性的主要有： 抗坏血酸及其钠盐 异抗坏血酸及其钠盐 植酸 除了有抗氧化作用外，还用于食品的护色、保持风味等。 一、主要抗氧化剂的性质与毒性 1、BHT （C15 H 24O ） 不溶于水，溶液于油脂及酒精等 抗氧化能力强，耐热性好 LD50：1700~2000mg/kg体重 ADI：0.5mg/kg体重 C(CH3) 3 CH3 OH (CH3) 3 C 2017/2/25

2、BHA（C11H16O2 ） 两种异构体： 3-BHA和2-BHA 不溶于水，溶于油脂和酒精，易溶于丙二醇 对热相当稳定，在弱碱性条件下不易被破坏 与金属离子不着色 抗霉效力较对羟基苯酸丙酯高 LD50：2900mg/kg体重 ADI：0.5mg/kg体重 C(CH3) 3 OH OCH3 C(CH3) 3 OH OCH3 2017/2/25

3、PG（C10H12O5 ） 易溶于乙醇、乙醚、丙酮，难溶于氯仿、脂肪与水，有吸湿性； 对热稳定，见光易分解。 易与铜、铁等金属离子反应呈紫色或暗紫色，当与柠檬酸或酒石酸混用时，因鳌合作用，不仅可增效，还可防止变色。 它对猪油的抗氧化作用较BHA或BHT强，加增效剂效果更好。 LD50：2000~3500mg/kg ADI: 0.2mg/kg 2017/2/25

二、抗氧化剂的卫生标准 名称 使用范围 最大使用量g/kg 备注 丁基羟基茴香醚BHA   油脂、油炸食品、干鱼制品、饼干、速煮面、速煮米、干制食品、罐头、腌腊肉制品 0.2 抗氧化剂(1)与(2)混合使用时，总量不得超过0.2g/kg;（1）、（2）、（3）混合使用时，(1)和 (2)总量不得超过0.1g/kg,(3)不得超过0.05g/kg 最大使用量以脂肪计 二丁基羟基甲苯BHT 没食子酸丙酯PG 0.1 叔丁基对苯二酚（TBHQ） 异抗坏血酸钠 果蔬罐头、果酱、冷冻鱼 1.0 啤酒 0.04 瓶装葡萄酒、果汁饮料类 0.15 肉及肉制品 0.50 2017/2/25

三、食品中BHA和BHT的测定 GB5009.30-1996规定了气相色谱法、薄层色谱法、比色法测定食品中BHA和BHT含的方法。其中比色法主要适用于BHT的测定。 气相色谱法的最低检出量为2μg，比色法最低检出量为10μg。 1.气相色谱法 （1）方法原理 样品中的BHA和BHT用石油醚提取，通过柱层析净化，用二氯甲烷洗脱，浓缩后，经气相色谱分析，根据样品峰高与标准峰高比较定量。 2017/2/25

（2）试剂 石油醚：沸程30-60℃ 二氯甲烷、 二硫化碳 无水硫酸钠 硅胶：60~80目于120℃活化4小时，备用。 二氯甲烷、 二硫化碳 无水硫酸钠 硅胶：60~80目于120℃活化4小时，备用。 弗罗里矽土：60~80目，于120℃活化4小时，备用。 BHA、BHT混合标准储备液：准确称取BHA、BHT各0.1000g混合后用二硫化碳溶解，定容至100mL，此溶液每毫升分别含有1.0mgBHA和BHT，置冰箱保存。 BHA、BHT混合标准使用液：吸取标准储备液4mL于100mL容量瓶中，用二硫化碳定容至100mL，此溶液每毫升分别含有0.040mgBHA和BHT，置冰箱保存。 2017/2/25

色谱柱：长1.5m，内径3mm玻璃柱，内装涂有10%QF-1（或采用OV-1固定液）的Gas Chrom Q（80~100目）的担体。 （3）仪器 气相色谱仪：附氢火焰离子化检测器。 蒸发器或其它类型的减压浓缩装置 振荡器 层析柱：1×30cm 色谱条件（参考）： 色谱柱：长1.5m，内径3mm玻璃柱，内装涂有10%QF-1（或采用OV-1固定液）的Gas Chrom Q（80~100目）的担体。 检测器：FID 温度：柱温140℃，进样口温度200℃，检测器温度200℃ 载气流量：氮气70mL/min，燃气：氢气50mL/min，助燃气：空气500mL/min 2017/2/25

（4）分析步骤 样品处理 样品制备 抽提脂肪 试样液制备 层析柱制备（湿法装柱） 测定（外标法） （5）计算 2017/2/25

展开剂：正已烷-二氧六环-乙酸（42+6+3）（硅胶板用） 异辛烷-丙酮-乙酸（70+5+12）（硅胶板用） 2、薄层色谱法 （1）原理 用甲醇提取油脂或食品中脂肪的抗氧化剂，用薄层色谱定性，根据其在薄层板上显色的最低检出量，与标准最低检出量比较概略定量，对高脂肪含量的食品中的BHA、BHT、PG能定性要检出。 （2）试剂 溶剂及提取剂：甲醇、石油醚 展开剂：正已烷-二氧六环-乙酸（42+6+3）（硅胶板用） 异辛烷-丙酮-乙酸（70+5+12）（硅胶板用） 甲醇-丙酮-水（30+10+10）（芝麻油用） 甲醇-丙酮-水（30+10+10）（菜籽油用） 甲醇-丙酮-水（30+10+10）（食品用） 聚 酰 板 用 2017/2/25

薄层板制备、点样、展开、显色、定性分析、概述较为合理。 吸附剂：硅胶、聚酰胺粉 显色剂：2，6-二氯醌-氯亚胺乙醇溶液 （3）仪器 减压浓缩 玻璃板、层析槽、微量注射器 （4）测定步骤 提取 植物油： 甲醇提取、离心、浓缩 猪油：甲醇提取、冰浴分层、过滤、浓缩 食品：石油醚抽脂、 测定 薄层板制备、点样、展开、显色、定性分析、概述较为合理。 2017/2/25

BHT、BHA、PG在薄层板上的最低检出量、Rf值及斑点颜色   抗氧化剂 硅胶G板 聚酰胺板 Rf值 最低检出量 μg 色斑颜色 最低检出量 μg BHT 0.73 1 桔红→紫红 —— BHA 0.37 0.3 紫红→蓝紫 0.52 灰棕 PG 0.04 灰 →黄棕 0.66 蓝 2017/2/25

四、油脂中PG的测定 1.测定原理 样品经石油醚溶解，用乙酸铵水溶液提取后，没食子酸（PG）与亚铁酒石酸盐起颜色反应（产物为紫红色），在波长540nm处测定吸光度，与标准比较定量。 2.试剂 （1）石油醚：沸程30~60℃ （2）乙酸铵溶液（100g/L及16.7g/L） （3）显色剂：称取0.100g硫酸铁和0.500g酒石酸钾钠，加水溶解，稀释至100ml。临用时现配。 （4）PG标准溶液：准确称取10.0mgPG溶于水为，移入200ml容量瓶中，并用水稀释至刻度。此溶液每毫升含50.0μg PG。 2017/2/25

3、分析步骤 样品处理 溶解（石油醚）、乙酸铵提取 测定 标准曲线制备 样品测定 4、计算 2017/2/25

第五节 食品中发色剂的测定 在肉类制品中为了保持其鲜红的色泽，经常使用发色剂或称护色剂 常用的发色剂主要有硝酸盐和亚硝酸盐、抗坏血酸及尼克酰胺等。 发色剂与色素的区别是在于发色剂是通过化学反应使食品保持本色。 肉制食品经空气氧化肌红蛋白可变成高铁肌红蛋白，失去原有的鲜红色泽，硝酸盐在用于肉制品时可在亚硝基化细菌作用下，还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐在酸性条件下与肌红蛋白结合生成亚硝基肌红蛋白，从而使肉制品在热加工后仍保持红色。既使食品具有独特的风味，又具有较强的抑菌作用，尤其是抑制肉毒梭菌的生长，因此又是防腐剂。 2017/2/25

硝酸钠（Sodiμm Nitrate NaNO3）为白色粉末，味咸、苦，溶于水。 蔬菜是富含硝酸盐的食品，蔬菜在贮存和加工不良的条件下蔬菜中的硝酸盐在硝酸盐还原酶的作用下可转变为亚硝酸盐，一般不新鲜的蔬菜、变质的酱菜腌菜、腌制初期的腌菜、保存不好的熟菜中都可检出亚硝酸盐。 硝酸钠（Sodiμm Nitrate NaNO3）为白色粉末，味咸、苦，溶于水。 硝酸钠的LD50为3200mg/kg， ADI为5mg/kg体重（不包括食品中天然存在量）。 硝酸盐在细菌作用下可还原为亚硝酸盐，若饮水中含有100mg/kg（以NO3-计），即可引起婴儿中毒，个别情况下50mg/kg可引起中毒。 2017/2/25

亚硝酸钠（Sodium Nitrite NaNO2）为白色或淡黄色结晶，无臭，微咸，吸湿性强，溶于水，在空气中易氧化为硝酸盐。 亚硝酸钠的LD50为220mg/kg ADI为0.2mg/kg（以NaNO2计） 亚硝酸盐可使血液中二价铁离子氧化为三价铁离子，使正常血红蛋白转变为高铁血红蛋白，失去携氧能力，出现亚硝酸盐中毒症状。 2017/2/25

亚硝酸钠还可干扰碘的代谢，造成甲状腺肿大、氧化破坏维生素A和影响体内胡萝卜素向维生素A的转化，并可抑制动物生长发育，缩短寿命。 亚硝酸盐又是致癌性N-亚硝基化合物的前体物，研究证明人体内和食物中的亚硝酸盐只要与胺类或酰胺类同时存在，就可能形成致癌性的亚硝基化合物。因此我国制订食品中的卫生标准及其允许使用量标准。 2017/2/25

食品中硝酸盐和亚硝酸盐卫生标准 名称 使用范围 最大使用量 备注 硝酸钠 肉类制品 0.5g/kg 残留量以亚硝酸钠计，肉类罐头不得超过0.05g/kg;肉制品不得超过0.03g/kg 亚硝酸钠 肉类罐头 0.15g/kg 2017/2/25

肉类制品中亚硝酸盐允许量标准 品种 指标 灌肠类 30 粮食 3 肴肉 蔬菜 4 广式腊肉 20 鱼类 西式火腿罐头 70 蛋类 5 其它腌制罐头 50 酱腌菜 西式蒸煮、烟薰火腿 牛乳粉 2 火腿 乳制品 按牛乳计 香肠 食盐 肉类 2017/2/25

（一）格里斯试剂比色法——亚硝酸盐的测定 食品中亚硝酸盐与硝酸盐含量的分析 （一）格里斯试剂比色法——亚硝酸盐的测定 1 原理 样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N-1-萘基乙二胺偶合形成紫红色染料，与标准比较定量。 2017/2/25

（6）显色剂：临用前将N-1-萘基乙二胺溶液（1g/L）和对氨基苯磺酸溶液等体积混合。 2 试剂 （1）氯化铵缓冲液 （2）硫酸锌溶液（0.4mol/L） （3）氢氧化钠溶液（20g/L） （4）对氨基苯磺酸溶液(1g/L) （5）N-1-萘基乙二胺溶液（1g/L） （6）显色剂：临用前将N-1-萘基乙二胺溶液（1g/L）和对氨基苯磺酸溶液等体积混合。 （7）亚硝酸钠标准溶液(5.0μg /ml) 2017/2/25

称样—绞碎—调pH—水浴—定容—静置—过滤 （2）测定 标准曲线制备 标准使用液—加缓冲液—加酸、显色剂—定容—静置—测吸光度—绘制标准曲线 3、分析方法 （1）样品处理 称样—绞碎—调pH—水浴—定容—静置—过滤 （2）测定 标准曲线制备 标准使用液—加缓冲液—加酸、显色剂—定容—静置—测吸光度—绘制标准曲线 样品测定 4、计算 2017/2/25

（二）镉粉还原比色法——硝酸盐的测定 原理 样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，溶液通过镉柱（或加入镉粉），使其中的硝酸根离子还原成亚硝酸根离子，在弱酸性条件下，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N-1-萘基乙二胺偶合形成红色染料，测得亚硝酸盐总量，由总量减去亚硝酸盐含量即得到硝酸盐含量。 试剂 镉柱（镉粉） 海绵状镉粉制备 镉柱还原效率的测定 镉粉还原效率的测定 2017/2/25

3 分析方法 样品处理 测定 镉柱还原法 镉粉还原粉 4 计算 2017/2/25

第六节 漂白剂的测定 一、主要漂白剂的性质 食品中有色物质经化学处理变成白色或无色，称为漂白，因此能破坏或抑制食品发色因素，使食品褪色或使食品免于褐变的添加剂称为漂白剂。按其性质可分为氧化性漂白剂和还原性漂白剂。氧化性漂白剂是使有色物质经氧化分解而达到漂白的目的，如次氯酸钠、过氧化氢等，我国在食品中使用的漂白剂主要是还原性漂白剂。如硫磺、亚硫酸钠、低亚硫酸钠、焦亚硫酸钠等。 另外，在面粉生产中为了达到较好的外观品质，生产企业常常添加过氧化苯甲酰，使面粉中的胡萝卜素、黄色素褪色，起到增白的作用。 2017/2/25

无色或白色结晶，易溶于水，水溶液呈碱性，在空气中可风化为硫酸钠。与酸反应生产二氧化硫，二氧化硫遇水生成亚硫酸而发挥其漂白作用。 1.亚硫酸钠（Na2SO3·7H2O） 无色或白色结晶，易溶于水，水溶液呈碱性，在空气中可风化为硫酸钠。与酸反应生产二氧化硫，二氧化硫遇水生成亚硫酸而发挥其漂白作用。 亚硫酸对细菌、霉菌、酵母菌等有抑制作用，在酸性条件下具有防腐效果，我国在食品加工中多用于处理水果或其半成品。 2017/2/25

⑴亚硫酸为强还原剂可有效地消耗组织中的氧而阻断微生物重量氧化过程，抑制微生物的繁殖； 亚硫酸的漂白与防腐机理为： ⑴亚硫酸为强还原剂可有效地消耗组织中的氧而阻断微生物重量氧化过程，抑制微生物的繁殖； ⑵ 亚硫酸被氧化时可将有色物质还原褪色，使食品保持鲜艳色泽； ⑶ 亚硫酸的漂白作用是由于与非酶促褐变过程的中间产物结合，也可与酶促褐变过程的氧化酶作用，同时对类黑精色素具有漂白作用， 因而亚硫酸有效地抑制了食品褐变（包括酶性褐变和非酶性褐变）。 2017/2/25

亚硫酸盐在人体内被代谢为硫酸盐，通过解毒过程排出到体外，一天摄入游离的亚硫酸4~6克对肠胃有刺激作用，过量摄入可发生多发神经炎与骨髓萎缩等症状，并可引起生长障碍。亚硫酸在食品中存在时可破坏食品中的硫胺素（维生素B1）。亚硫酸盐不适用于肉、鱼等动物性食品，因为其残留的气味会掩盖肉、鱼等食品的腐败味而引起细菌性食物中毒。因此我国对其使用范围和用量都作了规定。 2017/2/25

2.低亚硫酸钠(Na2S2O4)又称保险粉以及 焦亚硫酸钠（Na2S2O5）的性质和毒性与亚硫酸钠相似。 3.过氧化苯甲酰又称过氧化二苯甲酰，是一种商品面粉品质改良剂和漂白剂，目前在制粉行业应用十分广泛。其分子式为C14H10O4，结构式为： 添加到面粉中后，遇还原性物质分解为苯甲酸。 2017/2/25

二、食品中漂白剂的允许量标准 （一）我国食品卫生标准 食品添加剂使用卫生标准（GB2760-1996） 名称 使用范围 最大使用量(g/kg) 备注 亚硫酸钠 蜜饯类、饼干、罐头、葡萄糖、食糖、冰糖、饴糖、糖果、液体葡萄糖、竹笋、蘑菇 0.6 残留量以二氧化硫计，竹笋、蘑菇残留量不得超过0.025g/kg,饼干、食糖、粉丝、罐头不得超过0.05g/kg,其它品种不得超过0.1g/kg 低亚硫酸钠 0.4 焦亚硫酸钠 0.45 硫磺 蜜饯类、干果、干菜、粉丝、食糖 只限用于熏蒸 2017/2/25

（二）国际食品法典委员会及日本等国家与地区对食品漂白剂的有关规定。 国家或组织 使用范围 SO2残留量mg/kg 备注 CAC 白糖 20~70 糖粉 20 绵糖 40 物理法保存的杏、桃、梨蜜汁、桔汁 10 对虾、速冻虾 100/30 单用或合用 欧共体 速冻法式土豆 50 日本 杏干、桃干 2000* 为最大允许使用量 菠萝干 500* 2017/2/25

食品中亚硫酸盐的测定 GB/T 5009-1996规定了盐酸副玫瑰苯胺法及蒸馏法两种亚硫酸盐的测定方法。 （一）盐酸副玫瑰苯胺法 本方法适用于食品中游离型和结合型的亚硫酸盐残留量的测定，方法操作简单、快速、灵敏度高（最低检出浓度为1mg/kg）、再现性好。 1 原理 亚硫酸盐与四氯汞钠反应生成稳定的络合物，再与甲醛及盐酸副玫瑰苯胺作用生成紫红色络合物，与标准系列比较定量。 2017/2/25

（1）四氯汞钠吸收液 （2）氨基磺酸铵溶液（12g/L） （3）甲醛溶液（2g/L） （4） 1%淀粉指示剂 2 试剂 （1）四氯汞钠吸收液 （2）氨基磺酸铵溶液（12g/L） （3）甲醛溶液（2g/L） （4） 1%淀粉指示剂 （5）亚铁氰化钾溶液 （6）乙酸锌溶液：22% （7）氢氧化钠溶液（20g/L） （8）硫酸（1+17） （9）盐酸副玫瑰苯胺溶液：0.02% （10）碘溶液[ c（1/2 I2）=0.1mol/L] （11）硫代硫酸钠标准溶液[c（Na2S2O3·5H2O）=0.1mol/L] （12）二氧化硫标准溶液：称取500mg亚硫酸氢钠，溶于200ml四氯汞钠吸收液中，放置过夜，上清液用定量滤纸过滤备用。（以硫代硫酸钠标准溶液标定其浓度。 （13）二氧化硫标准使用液：临用前将二氧化硫标准溶液以四氯汞钠吸收液稀释成每毫升相当于2μg二氧化硫。 2017/2/25

3. 样品处理 ①水溶性固体样品如白糖等: 可称取约10.00g均匀样品（样品量可视含量高低而定），以少量水溶解，置于100ml容量瓶中，加入4ml氢氧化钠溶液（20g/L），5min后加入硫酸（1+17），然后加入20ml四氯汞钠吸收液，以水稀释至刻度。 样 品 容量瓶 NaOH H2SO4 Na2HgCl4 2017/2/25

②其它固体样品如饼干、粉丝等: 可称取5.00~10.00g研磨均匀的样品，以少量水湿润并移入100ml容量瓶中，然后加入20ml四氯汞钠吸收液，浸泡4h以上，若上层溶液不澄清可加入亚铁氰化钾溶液及乙酸锌溶液各2.5ml，最后用水稀释至100ml刻度，过滤后备用。 样 品 容量瓶 Na2HgCl4 Zn(CH3COO)2 K2 [ Fe(CN)4]6 2017/2/25

③液体样品如葡萄酒等可直接吸取5.00~10.00ml 样品，置于100ml容量瓶中，以少量水稀释，加20ml四氯汞钠吸收液，摇匀，最后加水至刻度，混匀，必要时过滤备用。 样 品 容量瓶 Na2HgCl4 2017/2/25

吸取0.50~5.0ml上述样品处理液于25ml具塞试管中。 4 测定 吸取0.50~5.0ml上述样品处理液于25ml具塞试管中。 另吸取0,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00,1.50,2.00ml二氧化硫标准使用液（相当于0,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0,3.0,4.0μg二氧化硫）分别置于25ml具塞比色管中。 于样品及标准管中各加入四氯汞钠吸收液至10ml，然后再加入1ml氨基磺酸铵溶液（12g/L）、1ml甲醛溶液（2g/L）及1ml盐酸副玫瑰苯胺溶液，摇匀，放置20min。用1cm比色杯，以零管调节零点，于波长550nm处测吸光度，绘制标准曲线，比较定量。 2017/2/25

标准曲曲及样品测定 1 2 3 4 5 6 7 样品 标准使用液体积 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.50 2.00 0.5~5.0 加Na2HgCl4 至10mL 加氨基磺酸胺 1mL 加甲醛溶液 加盐酸副玫瑰苯胺溶液 1mL(摇匀,静置20min) 比色测吸光度 1cm比色皿,550nm,0管调零 2017/2/25

式中：X2——样品中二氧化硫的含量，g/kg； A1——测定用样液中二氧化硫的含量，μg； m1——样品质量，g； 5 计算 A1×1000 X2= ————————————— m1×V3/100×1000×1000 式中：X2——样品中二氧化硫的含量，g/kg； A1——测定用样液中二氧化硫的含量，μg； m1——样品质量，g； V3——测定用样液的体积，ml。 结果取算术平均值的三位有效数字。允许相对相差≤10%。 2017/2/25

适用于色酒、葡萄糖糖浆及果脯中亚硫酸盐的测定。 （二）蒸馏法 适用于色酒、葡萄糖糖浆及果脯中亚硫酸盐的测定。 1 原理 在密闭器中对样品进行酸化并加热蒸馏，释放出其中的二氧化硫，释放物用乙酸铅溶液吸收。吸收后用浓盐酸酸化，再以碘标准溶液滴定，根据所消耗的碘标准量计算出样品中的二氧化硫含量。 加热蒸馏 乙酸铅吸收 盐酸酸化 碘量法滴定 2017/2/25

（3）碘标准溶液[ c（1/2 I2）=0.01mol/L] 2 试剂 （1）盐酸（1+1） （2）乙酸铅溶液（20g/L） （3）碘标准溶液[ c（1/2 I2）=0.01mol/L] （4）淀粉指示剂：称取1g可溶性淀粉，用少许水调成糊状，缓缓倾入100ml沸水中，边加边搅拌，煮沸，放冷备用（临用现配）。 3 仪器：全玻璃蒸馏器、 碘量瓶、酸式滴定管 2017/2/25

4 分析步骤 ①样品处理 固体样品用刀切或剪刀剪成碎末后混匀，称取约5.00g均匀样品（样品量视含量高低而定）。液体样品可直接吸取5.0ml~10.0ml样品，置于圆底蒸馏烧瓶中。 样品处理 蒸 馏 滴 定 2017/2/25

②蒸馏：将称好的样品置于圆底蒸馏烧瓶中，加入250ml水，装上冷凝装置，冷凝管下端应插入碘量瓶中的预先装入的25ml乙酸铅吸收液（20g/L）中，然后在蒸馏瓶中加入10ml盐酸（1+1），立即盖塞，加热蒸馏。当蒸馏液约200ml时，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min。用少量蒸馏水冲洗插入乙酸铅溶液的装置部分。在检测样品的同时做空白试验。 样品 盐酸 乙酸铅 水 2017/2/25

③滴定：向取下的碘量瓶中依次加入10ml浓盐酸、1ml淀粉指示剂。摇匀后用碘标准溶液（0.01mol/L）滴定至变蓝且30s内不褪色为止。 2017/2/25

式中：X3——样品中二氧化硫的含量，g/kg； A2——滴定样品液所用碘标准溶液（0.01mol/L）的体积，mL； 5 计算 （A2－Ｂ）×0.01 × 0.032 ×1000 X3= —————————————————— 　　　 m2 式中：X3——样品中二氧化硫的含量，g/kg； A2——滴定样品液所用碘标准溶液（0.01mol/L）的体积，mL； B ——滴定试剂空白所用碘标准溶液（0.01mol/L）的体积，mL； m2——样品质量，g； 0.032——与1ml碘标准溶液[c(1/2 I2)=1.000mol/L]相当于二氧化硫的质量。 2017/2/25

食品中过氧化苯甲酰的测定 过氧化苯甲酰的测定方法主要有：气相色谱法、比色法等。GB/T 18415-2001中规定了两种应用不同前处理方法的气相色谱分析方法。 气相色谱法-1 1 原理 小麦粉中的过氧化苯甲酰被还原铁粉和盐酸反应产生的原子态氢还原，生成苯甲酸，经提取净化后，用气相色谱仪测定，与标准系列比较定量。 2017/2/25

1%碳酸氢钠的5%氯化钠水溶液：称取1g碳酸氢钠溶于100mL5%氯化钠溶液中。 2 试剂 乙醚 丙酮 石油醚(沸程60℃～90℃) 盐酸 还原铁粉 氯化钠 碳酸氢钠 盐酸，l+1(V/V) 5%氯化钠溶液 1%碳酸氢钠的5%氯化钠水溶液：称取1g碳酸氢钠溶于100mL5%氯化钠溶液中。 石油醚—乙醚(3+l，V/V)：量取3体积石油醚与1体积乙醚混合。 苯甲酸(含量99.95%～100.05%)，基准试剂。 苯甲酸标准贮备溶液：准确称取苯甲酸(基准试剂)0.1000g，用丙酮溶解并转移至100mL容量瓶中，定容。此溶液浓度为1 mg/mL。 苯甲酸标准使用液：准确吸取上述苯甲酸标准贮备溶液10.00mL于100mi。容量瓶中，以丙酮稀释并定容，此溶液浓度为100ug/mL。 2017/2/25

铁粉、乙醚 三角瓶 过滤 3 仪器和设备 气相色谱仪，附有氢火焰离子化检测器。 10uL微量注射器。 4分析步骤 ⑴样品前处理 准确称取试样5.00g于具塞三角瓶中，加入0.0lg还原铁粉、约20粒玻璃珠(Φ6 mm左右)和20mL乙醚，混匀。逐滴加入0.5mL盐酸，回旋摇动，用少量乙醚冲洗三角瓶内壁，放置至少12h后，摇匀，静置片刻，将上清液经快速滤纸滤入分液漏斗中。用乙醚洗涤三角瓶内的残渣，每次15mL(工作曲线溶液每次用10mL)，共洗三次，上清液一并滤入分液漏斗中。最后用少量乙醚冲洗过滤漏斗和滤纸，滤液合并于分液漏斗中。 铁粉、乙醚 盐酸 称样 三角瓶 摇匀、静置12h 过滤 分液漏斗 2017/2/25

向分液漏斗中加入5%氯化钠溶液30mL，回旋摇动30s，防止气体顶出活塞，并注意适时放气。静置分层后，弃去下层水相溶液。重复用氯化钠溶液洗涤一次，弃去下层水相。加入1%碳酸氢钠的5%氯化钠水溶液15mL，回旋摇动2min(切勿剧烈振荡，以免乳化，并注意适时放气)。待静置分层后，将下层碱液放入已预置3~4勺固体氯化钠的50mL比色管中。分液漏斗中的醚层用碱性溶液重复提取一次，合并下层碱液于比色管中。加入0.8mL盐酸(1+1)，适当摇动比色管以充分驱除残存的乙醚和反应产生的二氧化碳气体(室温较低时可将试管置于50℃水浴中加热，以便于驱除乙醚)，至确认管内无乙醚的气味为止。加入5.00mL石油醚—乙醚(3+1)混合溶液，充分振摇l min，静置分层。上层醚液即为进行气相色谱分析的测定液。 分液漏斗 NaCl溶液 振摇，分层 乙醚相 水相弃去 成盐 碱性NaCl溶液 比色管 酸化 提取 HCl 石油醚-乙醚 2017/2/25

以微量注射器分别取不同浓度的苯甲酸溶液2.0uL注入气相色谱仪。以其苯甲酸峰面积为纵坐标，苯甲酸浓度为横坐标，绘制工作曲线。 2 制作工作曲线 准确吸取苯甲酸标准使用液0、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mL，置于150mL具塞三角瓶中，除不加还原铁粉外，其他操作同样品前处理。其测定液的最终浓度分别为0、20、40、60、80和100ug/mL。 以微量注射器分别取不同浓度的苯甲酸溶液2.0uL注入气相色谱仪。以其苯甲酸峰面积为纵坐标，苯甲酸浓度为横坐标，绘制工作曲线。 2017/2/25

进样：用10uL微量注射器取2.0uL测定液，注入气相色谱仪，取试样的苯甲酸峰面积与工作曲线比较定量。 4 结果计算 3 测定 色谱条件：内径3 mm、长2m的玻璃柱，填装涂布5%(m/m)DEGS十1%磷酸固定液的(60～80)目Chromosorb W/AW DMCS。调节载气(氮气)流速，使苯甲酸于(5～10)min出峰。柱温为180℃，检测器和进样口温度为250℃。不同型号仪器调整为最佳工作条件。 进样：用10uL微量注射器取2.0uL测定液，注入气相色谱仪，取试样的苯甲酸峰面积与工作曲线比较定量。 4 结果计算 试样中的过氧化苯甲酰含量按下式进行计算： 2017/2/25

1 原理 小麦粉中的过氧化苯甲酰在酸性条件下被还原，生成苯甲酸，以溶剂提取并用气相色谱法测定。 2试剂 石油醚(60℃～90℃) 冰乙酸 气相色谱法-Ⅱ 1 原理 小麦粉中的过氧化苯甲酰在酸性条件下被还原，生成苯甲酸，以溶剂提取并用气相色谱法测定。 2试剂 石油醚(60℃～90℃) 冰乙酸 酸性石油醚：在500mL石油醚中加入15mL冰乙酸，混匀备用。 苯甲酸(含量99.95%～100.05%)，基准试剂。 苯甲酸标准贮备溶液：准确称取苯甲酸(基准试剂)0.1000g，用丙酮溶解并转移至100mL。容量瓶中，定容。此溶液浓度为1 000ug/mL。 苯甲酸标准溶液：由上述苯甲酸标准贮备溶液逐级稀释，制备成浓度为0、5、10、15和20ug/mL的苯甲酸标准溶液，供制作标准曲线用。 2017/2/25

称样 三角瓶 搅拌分散 恒温静置 过滤 定容 酸性石油醚 3 仪器和设备 气相色谱仪，附有氢火焰离子化检测器。 10uL微量注射器。 4 分析步骤 ⑴测定液的制备 准确称取试样5.00g，移入具塞三角瓶中，加入30mL酸性石油醚和搅拌块，以磁力搅拌器将试样分散(也可直接用手工操作，将试样旋荡分散)，于30℃恒温放置，并每隔15min搅拌或旋荡一次。4h后样品溶液经滤纸过滤，收集滤液于50mL容量瓶中。分数次用酸性石油醚将三角瓶中残余试样尽量洗入过滤漏斗，收集滤液于容量瓶中。最后以少许酸性石油醚淋洗过滤漏斗中的试样残渣并用以定容，作为试样测定液。 称样 三角瓶 搅拌分散 恒温静置 过滤 定容 酸性石油醚 2017/2/25

以微量注射器依次取不同浓度的苯甲酸标准溶液2.0uL，注入气相色谱仪。以其苯甲酸峰面积为纵坐标，苯甲酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。 ⑵标准曲线的制作 以微量注射器依次取不同浓度的苯甲酸标准溶液2.0uL，注入气相色谱仪。以其苯甲酸峰面积为纵坐标，苯甲酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。 ⑶测定 色谱条件：内径3mm、长2m的玻璃柱，填装涂布5%(m/m)DEGS+1%磷酸固定液的Chromosorb W／AW DMCS(60目~80目)。 调节载气(氮气)流速，使苯甲酸于(5～10)min出峰。 柱温为160℃，恒温10min后，以10℃／min的升温速率程序升温至190℃，并保持恒温至32min，完成测试。 检测器和进样口温度为250℃。 进样：以10uL微量注射器吸取2.0uL测定液，注入气相色谱仪，取试样的苯甲酸峰面积与标准曲线比较定量。 2017/2/25

试样中的过氧化苯甲酰含量按下式进行计算： 5结果计算 试样中的过氧化苯甲酰含量按下式进行计算： 2017/2/25

第七节 着色剂的测定 着色剂（colorant）也称食用色素，用于食品的着色，以改善食品的色泽，增进大众对食品的嗜好性，对改善食品质量有很大的作用。着色素按来源可分为天然和人工合成两类。天然着色剂主要来自于动、植物组织或微生物代谢产物，多数比较安全，有些还有一定的营养价值，但个别的也具有毒性，如藤黄有剧毒不能用于食品。另外，天然色素在生产过程中因其化学结构的可能变化和有害杂质的引入，也会引起天然色素可能具有一定的毒性。1860年前后化学合成色素开始用于食品中，以后相继发生过多起中毒事故。 2017/2/25

我国允许使用的天然色素主要有：植物色素（如甜菜红、姜黄、叶绿素铜钠盐、辣椒红β-胡萝卜素、可可壳色素等）、昆虫类色素（如虫胶红色素）、微生物色素（如红曲色素）、酱色等。在酱色生产过程中，为了加速反应速度往往加入铵盐作为催化剂，很易生成氮杂环化合物类代谢产物—4-甲基咪唑，毒理学试验结果表明，4-甲基咪唑为致惊厥物。国外规定加铵法生产的酱色中4-甲基咪唑含量不得超过200mg/kg，我国只允许使用不加铵盐的酱色。 2017/2/25

人工合成色素的主要特点为着色力强，色泽鲜艳，成本较低，但人工合成色素是从煤焦油中制取，或以苯、甲苯、萘等芳香烃化合物为原料合成制得，因此又称煤焦油色素或苯胺色素。这类色素多属偶氮化合物，在体内进行转化可形成芳香胺，芳香胺在体内经N-羟化和酯化可转变为易与生物大分子亲核中心结合的终致癌物，而具有致癌性。另外人工合成色素在合成过程中可能会因原料不纯而受到有害物质（如铅、砷等）的污染。我国批准使用的人工合成色素主要有苋菜红、胭脂红、赤藓红、新红、柠檬黄、日落黄、靛蓝、及亮蓝等。 2017/2/25

一、主要着色剂的性质与毒性 1.苋菜红（Amaranth）为1-氨基萘-4-磺酸经重氮化后与2-萘酚-3，6-二磺酸钠偶合而成的染料，是世界上许多国家常用的色素之一。其分子式为C20H11N2Na3O10S3，结构式为： 2017/2/25

毒理学试验证明有致肿癌性，有报道具有致畸性 苋菜红为红褐色或暗红色粒状粉末，溶于水、甘油、丙二醇，难溶于乙醇，不溶于油，耐光、耐热、耐盐，对柠檬酸、酒石酸稳定，遇碱呈暗红色，对氧化还原敏感。λmax=520±2nm。 毒理学试验证明有致肿癌性，有报道具有致畸性 代谢产物氨基苯磺酸钠与R盐对胎儿有毒，引起致死的剂量为200mg/kg，WHO规定苋菜红的ADI为0~0.5mg/kg体重。 国外允许使用在苹果沙司、梨罐头、果酱、果冻等食品中，使用量为0.2g/kg（单用或与其它着色剂混用），虾或对虾0.03g/kg（单用或与其它着色剂混用）；冷饮10.0g/kg。 2017/2/25

2. 胭脂红（Ponceau 4R）为1-氨基萘-4-磺酸经重氮化后与2-萘酚-6，8-二磺酸钠偶合而成的染料。 本品为红色或暗红色粒状粉末，溶于水呈红色、溶于甘油、乙醚，不溶于油，耐光、耐酸、不耐热，易还原，遇碱呈褐色。λmax=508±2nm。 毒理学试验结果显示，以0.05%、1%浓度饲喂大鼠未见异常现象。WHO规定ADI为0.125mg/kg体重。 2017/2/25

3.柠檬黄（Tartrazine，C16H9O9N4Na3S3）为双羟基酒石酸与苯肼对磺酸缩合，或对氨基苯磺酸经重氮化后与1-（4′-磺基苯）-3-羧基-5-吡唑酮偶合而成。其结构式为： 本品外观为橙黄或橙色粉末，溶于水呈黄色，溶于甘油，难溶于乙醇，不溶于油。耐光、耐热，对柠檬酸、酒石酸稳定，遇碱呈红色，还原时脱色，易氧化。λmax=428±2nm。 2017/2/25

国外允许使用在苹果沙司、梨罐头、果酱和果冻中为200mg/kg（单用或与胭脂红合用量）；速冻或罐装的虾或对虾0 国外允许使用在苹果沙司、梨罐头、果酱和果冻中为200mg/kg（单用或与胭脂红合用量）；速冻或罐装的虾或对虾0.030g/kg（单用或与其它着色剂合用量）；午餐肉0.015g/kg（仅用于补充因产品使用粘合剂而损失的色素）；发酵后热处理的增香酸奶为0.027g/kg（由增香剂带入）；冷饮0.1g/kg（色素总量可达0.28g/kg）。WHO建议ADI值为0~0.1mg/kg体重。 2017/2/25

本品外观为橙黄色粉末，溶于水、甘油、丙二醇，难溶于乙醇，不溶于油。耐光、耐热，对柠檬酸、酒石酸稳定，遇碱呈红褐色。λmax=482±2nm。 4.日落黄（Sunset yelLow, C16H10O7N2Na2S2）为对氨基苯磺酸经重氮化后与2-萘酚-6-磺酸钠偶合而成。其结构式为： 本品外观为橙黄色粉末，溶于水、甘油、丙二醇，难溶于乙醇，不溶于油。耐光、耐热，对柠檬酸、酒石酸稳定，遇碱呈红褐色。λmax=482±2nm。 2017/2/25

国外规定，可用于调味酱、果酱、果冻、桔皮果冻，最高限量为0. 2g/kg（单用或合用量）；虾或对虾罐头0 国外规定，可用于调味酱、果酱、果冻、桔皮果冻，最高限量为0.2g/kg（单用或合用量）；虾或对虾罐头0.030g/kg；发酵后热处理的增香酸奶0.0128g/kg（由增香剂带入）；冷饮0.10g/kg（最终产品内色素总量可达0.30g/kg）。WHO建议ADI为0~5.0mg/kg体重。 2017/2/25

5.靛蓝为蓝色粉末，溶于水的能力较苋菜红等稍差，溶于甘油、丙二醇，不溶于乙醇、油脂。着色力强，耐光、热、酸、碱`氧化能力差。λmax=610±2nm。其结构式为： 这种色素是美国于1970年批准使用的着色剂。美国规定的使用限量为糖果和蜜饯中0.1g/kg;饮料中为0.075g/kg；焙烤食品为0.05g/kg；冰淇淋、冻果汁为0.030g.kg，香肠、腊肠、红肠表面0.125g/kg。ADI为0~7mg/kg体重。 2017/2/25

二、主要人工合成着色剂的卫生标准 1.我国食品中着色剂的使用标准（GB2760-1996） 2.FAO/WHO规定的ADI值 苋菜红：0~0.5mg/kg体重 胭脂红：0~4mg/kg体重 赤藓红：0~0.1mg/kg体重 诱惑红：0~7mg/kg体重 日落黄：0~5mg/kg体重 柠檬黄：0~7.5mg/kg体重 亮蓝：0~12.5mg/kg体重 靛蓝：0~7mg/kg体重 2017/2/25

三、测定方法 食品中添加的色素大多是调配后使用，食品本身的颜色也是多元的，因此测定时关键在于各种色素的分离，常见的分离技术主要有纸色谱、薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱、羊毛吸附等。导数光谱、双波长吸收光谱等光谱分析方法及极谱等电化学方法也被应用于色素的测定。 测定食品中人工合成色素时，必须对样品进行前处理，去除样品中的糖、蛋白质、还原性物质等干扰物质，然后进行色素的提取、测定工作。 2017/2/25

提取色素的方法也有很多，如聚酰胺吸附法、羊毛染色法、离子交换法、分子筛分离法、吸附柱色谱法、溶剂抽提法、喹啉等化合物结合法。 国家标准方法（GB5009.35-1996）采用聚酰胺吸附法。对吸附和分离两种以上色素是目前较为理想的方法，并广泛使用。聚酰胺在酸性溶液中能与色素牢固地结合，并能在很稀的溶液中吸附色素，但对天然色素的吸附不紧密，能被甲醇-甲酸洗脱下来。 2017/2/25

本方法适用于清凉饮料、配制酒、糖、果汁等食品中酸性人工合成色素的测定。 （一）高效液相色谱法（GB/T5009.35-1996） 本方法适用于清凉饮料、配制酒、糖、果汁等食品中酸性人工合成色素的测定。 1.原理 食品中人工合成着色剂用聚酰胺吸附法或液液分配法提取，制成水溶液，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，根据保留时间定性和与峰面积比较进行定量。 2.试剂 3.仪器 2017/2/25

4.分析步骤 （1） 样品处理 ①桔子汁、果味水、果子露汽水等：称取20.0~40.0g样品，放入100ml烧杯中。含二氧化碳样品加热驱除二氧化碳。 ②配制酒类：称取20.0~40.0g，放100ml烧杯中，加小碎瓷片数片，加热驱除乙醇。 ③硬糖、蜜饯类、淀粉软糖等；称取5.00~10.00g，粉碎样品，放入100ml小烧杯中，加水30ml，温热溶解，若样品溶液pH较高，用柠檬酸溶液调pH值到6左右。 ④巧克力豆及着色糖衣制品：称取5.00~10.00g，放入100ml小烧杯中，用水反复洗涤色素，到巧克力豆无色素为止，合并色素漂洗液为样品溶液。 2017/2/25

样品溶液 调pH值 过滤 加热 水洗 醇-酸洗 聚酰胺 水洗 醇-碱-水洗 解吸 中和 蒸干 溶解定容 水 （2） 色素提取 ①聚酰胺吸附法：样品溶液加柠檬酸溶液调pH值到6, 加热至60℃，将1g聚酰胺粉加少量水调成粥状，倒入样品溶液中，搅拌片刻，以G3垂融分液漏斗抽滤，用60℃pH=4的水洗涤3~5次，然后用甲醇-甲酸混合液洗涤3~5次（含赤藓红的样品用液液分配法），再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3~5次，每次5ml。收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至5ml。经滤膜（0.45μm）过滤，取10μL进高效液相色谱仪。 样品溶液 调pH值 过滤 加热 水洗 醇-酸洗 聚酰胺 水洗 醇-碱-水洗 解吸 中和 蒸干 溶解定容 水 2017/2/25

分液漏斗 正已烷 氨水相 调pH 蒸馏 定容 氨水 样品液 有机相 水相 盐水洗 浓缩 乙酸 水 ②液-液分配法（适用于含赤藓红的样品）：将制备好的样品溶液放入分液漏斗中，加2ml盐酸、三正辛胺正丁醇溶液（5%）10~20mL，振摇提取，分取有机相，重复提取至有机相无色。合并有机相，用饱和硫酸钠溶液洗2次，每次10ml，分取有机相，放入蒸发皿中，水浴加热浓缩至10ml，转移至分液漏斗中，加60ml正已烷，混匀，加氨水提取2~3次，每次5mL，合并氨水溶液层（含水溶性酸性色素），用正已烷洗2次，氨水层加乙酸调至中性，水浴加热蒸发至近干，加水定容至5ml。经滤膜（0.45μm）过滤，取取10μL进高效液相色谱仪。 分液漏斗 正已烷 氨水相 调pH 蒸馏 定容 氨水 样品液 有机相 水相 盐水洗 浓缩 乙酸 水 2017/2/25

柱：YWG-C18 10μm不锈钢柱4.6mm(id)×250mm 流动相：甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液（pH=4） （3）高效液相色谱参考条件 柱：YWG-C18 10μm不锈钢柱4.6mm(id)×250mm 流动相：甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液（pH=4） 梯度洗脱：甲醇：20%~35%, 3%/min；35%~98%，9%/min；98%继续6min。 流速：1ml/min 紫外检测器，254nm波长 （4）测定 取相同体积液和合成着色剂 标准液分别注入高效液相色谱仪， 根据保留时间定性，外标峰面积 法定量。 （5）计算 2017/2/25

(二)薄层色谱法（GB/T509.35-1996） 本方法适用于各类食品中合成色素的测定。 3.仪器 1.原理 水溶性酸性合成着色剂在酸性条件下被聚酰胺吸附，而在碱性条件下解吸附，再用纸色谱法或薄层色谱法进行分离后，与标准比较定性及定量。 最低检出量为50μg，点样量为1g，样品最低检出浓度约为50mg/kg。 2.试剂 提取剂、 展开剂、标准溶液 3.仪器 2017/2/25

4.分析步骤 （1）样品处理[2] 果味水、果子露、汽水 配制酒 硬糖、蜜饯类、淀粉软糖 　（1）样品处理[2] 果味水、果子露、汽水 配制酒 硬糖、蜜饯类、淀粉软糖 奶糖：称取10.0g粉碎均匀的样品，加30ml乙醇-氨溶液溶解，置水浴上浓缩至20ml，立即用硫酸溶液（1+10）调至微酸性，再加1.0ml硫酸（1+10），加1ml钨酸钠溶液（100g/L），使蛋白质沉淀，过滤，用少量水洗涤，收集滤液。 样品 碱溶 浓缩 酸化 沉淀蛋白 过滤 2017/2/25

样品 吹干 脱脂 石油醚 碱溶 浓缩 酸化 沉淀蛋白 过滤 蛋糕类：称取10.0g粉碎均匀的样品，加海沙少许，混匀，用热风吹干用品，加入30ml 石油醚搅拌。放置片刻，倾出石油醚，如此重复处理三次，以除去脂肪，吹干后研细，全部倒入G3垂溶漏斗或普通漏斗中，用乙醇-氨溶液提取色素，直至着色剂全部提完，以下操作按奶糖处理方法进行。 样品 吹干 脱脂 石油醚 垂溶漏斗 碱溶 浓缩 酸化 沉淀蛋白 过滤 2017/2/25

（2）吸附分离 样品溶液 调pH值 过滤 加热 水洗 醇-酸洗 聚酰胺 水洗 醇-碱-水洗 解吸 中和 蒸干 溶解定容 水 2017/2/25

展开剂：正丁醇-无水乙醇-氨水（1%）：6+2+3 （3）定性 纸色谱 展开剂：正丁醇-无水乙醇-氨水（1%）：6+2+3 正丁醇-吡啶-氨水（1%）：6+3+4） 甲乙酮-丙酮-水（7+3+3） 薄层色谱 薄层板（聚酰胺+硅胶 板） 展开剂： 甲醇-乙二胺-氨水（10+3+2）：供苋菜红与胭脂红用。 甲醇-氨水-乙醇（5+1+10）：供靛蓝与亮蓝用。 柠檬酸溶液（25g/L）-氨水-乙醇（8+1+2）：供柠檬黄与 其它着色剂用。 2017/2/25

（4）定量 比色法定量 胭脂红510nm 苋菜红520nm 柠檬黄430nm 日落黄482nm 亮蓝627nm 靛蓝620nm （5）结果计算 2017/2/25