《园艺植物生物技术》 第九章：蔬菜生物技术研究进展 《园艺植物生物技术》 第九章：蔬菜生物技术研究进展 张余洋 华中农业大学蔬菜系

植物生物技术在蔬菜中的应用 蔬菜栽培方面 蔬菜育种方面 脱毒 快繁 细胞融合 小孢子培养 转基因 标记辅助选择育种 设计育种：通过计算机技术进行分子设计，以实现杂交亲本的最佳配组

International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications (ISAAA)

一. 蔬菜转基因研究进展 蔬菜抗病基因工程 蔬菜抗虫基因工程 蔬菜抗逆基因工程 蔬菜品质基因工程 延长蔬菜货架期

番茄转基因植株的再生

（诱导培养基+卡那霉素5mg/L+头孢霉素200 mg/L） 花椰菜转基因植株的再生 （诱导培养基+卡那霉素5mg/L+头孢霉素200 mg/L）

马铃薯转基因植株的再生 鄂马铃薯3号转基因试管薯薄片在卡那霉素选择培养基上再生芽 转基因植株在卡那霉素选择培养基上生根 1 2 3 4 5 6

蔬菜抗病毒基因工程 病毒来源基因 植物来源基因 病毒外壳蛋白基因 病毒复制酶基因介导抗性 病毒核酶（ribozymes）基因，可特异性催化切割RNA 利用核糖体失活蛋白（ribosome-inactivating protein，RIP）基因 植物来源基因 番茄抗TMV基因 植物真核翻译起始因子eIF4e

外壳蛋白介导的病毒抗性是经典的抗病毒基因工程 CMV-CP转基因辣椒（周钟信 等，1991；张宗江 等，1994 ） CMV-CP转基因番茄 （杨荣昌 等，1995） 苜蓿花叶病毒外壳蛋白(AMV-CP)转基因番茄（Nilgun 等） 西瓜花叶病毒（ WMV-I）CP 基因导入西瓜（唐慧中 等，2000） 芜菁花叶病毒CP基因（TuMV-CP）转化大白菜（朱常香 等，2001） 病毒复制酶基因转基因马铃薯（Braun等，1992）

miRNA介导的病毒抗性是未来新的研究方向 RNAi和miRNA技术被认为是一种介导病毒抗性极富前景的新技术。 针对CMV病毒2a/2b基因编码区和病毒RNA基因组的3’ 非翻译区的保守区域，设计miRNA,转化番茄,提高了番茄对CMV的抗性（张晓辉 等，2010）。 同时接种TMV和TYLCV后仍然保持对CMV病毒的稳定抗性，人工miRNA能够耐受非目标病毒的干扰。

利用人工miRNA培育抗CMV番茄 病毒抗性鉴定 病毒抗性鉴定 25 nt miRNA检测 CMV 接种后ELISA检测 mock 2b r1 a101 病毒抗性鉴定 CMV 接种后ELISA检测 a101 2b r1 mock 病毒抗性鉴定

蔬菜抗真菌基因工程 用于抗真菌转基因研究的基因包括几丁质酶基因，-1,3-葡聚糖酶基因，植物抗毒素基因，植物抗病基因等，其中几丁质酶基因研究最多。 机制：几丁质酶催化真菌细胞壁的重要成分（几丁质） 水解, 从而抑制真菌的生长 烟草渗调蛋白(osmotin)基因AP24和菜豆几丁质酶基因双价基因导入番茄，提高转基因番茄对番茄枯萎病菌的抗性（欧阳波 等，2005）

蔬菜抗细菌基因工程 蔬菜抗细菌基因工程主要利用抗菌肽基因等。 机制：在病原细菌的质膜上形成离子通道，从而破坏细胞内外渗透压平衡，细胞内容物尤其是K＋大量渗出，导致细胞死亡。 将抗菌肽基因导入到马铃薯和番茄中，获得对青枯病抗性提高的材料（贾士荣 等，1998；田长恩 等，2000） 天蚕（Hylophora cecropia）抗菌肽B基因和柞蚕（Antheraea pernyi）抗菌肽D基因构建成双价基因，导入到辣椒栽培种中，获得青枯病抗性提高的转基因辣椒（李乃坚 等，2000；余小林 等，2000 ）

将辣椒抗根结线虫基因CaMi导入番茄，提高对根结线虫的抗性 蔬菜抗线虫基因工程 将辣椒抗根结线虫基因CaMi导入番茄，提高对根结线虫的抗性

蔬菜抗线虫基因工程 CaMi 转基因莴苣 对照 转基因 线虫接种试验

蔬菜抗虫基因工程 细菌来源基因 植物来源基因 动物来源基因（用于棉花等作物） 苏云金杆菌杀虫结晶蛋白(Bt)基因 蛋白酶抑制剂基因 凝集素基因 动物来源基因（用于棉花等作物） 蝎毒素基因 蜘蛛毒素基因

Bt 转基因青花菜 苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因 转Bt基因甘蓝（毛慧珠 等，1996） 机制：与昆虫消化道特定受体结合，昆虫厌食。 原始Bt基因 针对密码子偏好差异修饰的Bt基因 解决潜在的害虫对Bt基因产生抗性 转Bt基因甘蓝（毛慧珠 等，1996） 转Bt基因花椰菜（华学军 等，1997；钟仲贤 等，2000 ） 转双价Bt基因青花菜（李汉霞 等，2010） Bt 转基因青花菜

蛋白酶抑制剂基因 转蛋白酶抑制剂基因（ CpTI ）小白菜（佘建明 等，2000；杨广东 等，2002) 将水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因转入甘蓝，抗虫性增强（雷建军 等，2002） 基因修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(SCK)导入甜椒，提高对棉铃虫的抗性；转SCK基因大白菜对菜青虫有一定的抗性

植物凝集素基因 转雪花莲凝集素基因（ GNA）莴苣（郭文俊 等，1998） 转GNA基因番茄，提高对蚜虫抗性（吴昌银 等，2000） 机制：外源凝集素在昆虫消化道中与肠道的糖蛋白专一性结合，影响昆虫对营养的吸收，从而达到杀虫目的。 转雪花莲凝集素基因（ GNA）莴苣（郭文俊 等，1998） 转GNA基因番茄，提高对蚜虫抗性（吴昌银 等，2000） 转GNA 基因大白菜，具抗蚜虫能力（杨广东 等，2003） 转GNA基因红菜薹（张扬勇 等，2003） 由于蚜虫是传播病毒病的一个重要媒介，因此，抗蚜虫转基因蔬菜可能对病毒病的防治具有积极效果。

如何解决抗性问题将成为抗虫基因工程的关键 抗虫转基因蔬菜中，若依赖单一抗性基因，昆虫可能产生抗性，应对转基因蔬菜的抗虫性 减少昆虫抗性的策略 筛选广谱性抗虫基因 双价或多价抗虫基因 提高外源基因表达活性：特异性和诱导型启动子，特定部位或特定时间表达抗虫基因 “高剂量/逃避所”系统：将转基因作物和非转基因作物混种

蔬菜抗逆基因工程 超量表达胆碱氧化酶基因（ CodA ）提高番茄耐冷性 Park et al., Plant J, 2004

离子通道蛋白编码基因 耐盐转基因番茄叶片中积累盐份，但果实中并不积累 转基因 对照 5 mM Salt Transgenic salt-tolerant tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit Transgenic tomato plants overexpressing a vacuolar Na+/H+ antiport were able to grow, flower, and produce fruit in the presence of 200 mM sodium chloride. 转基因 Nature biotechnology 2001 200 mM Salt 200 mM Salt 对照

超量表达CBF1基因提高番茄耐寒性 Overexpression of CBF1 Improve Cold tolerance Hsieh et al. Plant Physiol, 2002 Transgenic tomato plants overexpressing CBF1 display high level of tolerance to chilling stresses. For survival rate test, WT, C5, C15, and C21 were incubated at 0 oC for 7 d and returned to 24 oC for 5 d.

转ABRC1::CBF1基因番茄对低温、干旱和渗透胁迫的抗性 Transgenic ABRC1-CBF1 tomato plants exhibited more tolerance to chilling and osmotic stresses than untransformed plants. Lee et al. Plant, Cell & Environment 26: 1181-1190 冷害 0 oC for 7 d chilling stress ABRC1 : ABA-responsive complex ABA（响应启动原件） 干旱 调控转录因子比酶更有效 逆境响应启动子（ABA响应启动子）更有效，避免转基因植物的负面效果 4 weeks drought stress 盐胁迫 200 mm NaCl for 4 weeks