酶促反应动力学 是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学。

一、

影响酶促反应速度的因素 二.底物浓度对酶促反应速度的影响 在低底物浓度时, 反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。 1903年，Henri 用蔗糖酶水解蔗糖的实验 在低底物浓度时, 反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。 当底物浓度达到一定值，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。

（一）酶与底物的中间络合物学说（Henri和Wurtz） 该学说认为当酶催化某一化学反应时，酶首先和底物结合生成中间复合物（ES），然后生成产物（P），并释放出酶。 S+E ES P+E

（二）酶促反应的动力学方程式 S+E ES P+E 米氏方程 Ks k S+E ES P+E 1913年前后，Michaelis和Menten在前人工作的基础上，假定 S+E ES 快速建立平衡，底物浓度远远大于酶浓度，ES分解产物的逆反应忽略不计，推导出下列方程： 米氏方程

1.米氏方程的推导 在Michaelis和Menten的酶促反应动力学基础上，1925年，Briggs和Haldane提出酶反应分两步进行，即“稳态平衡”理论： 所谓稳态是指反应进行一段时间后，系统的复合物ES浓度，由零逐渐增加到一定数值，在一定时间内，尽管底物浓度和产物浓度不断地变化．复合物ES也在不断地生成和分解，但是当反应系统中ES的生成速率和ES的分解速率相等时，络合物ES浓度保持不变的这种反应状态称为稳态，即： 第一步： 第二步： ES的浓度与（1）（2）都有关系 [E] 为酶的总浓度 [ES] 为中产物浓度 [E]-[ES] 为游离酶浓度 [S] 为底物浓度 由于[S][E]所以 [S]-[ES][S] （1） （2） ES的形成速度为： （3） （4） ES的分解速度：

米氏方程 在稳态下，ES的生成速率和ES的分解速率相等，即[ES]保持动态平衡： 因为酶反应速率 与[ES]成正比，即： 由干反应系统中［S］＞＞［E]，当［S］很高时所有的酶都被底物所饱和形成ES，即［E]=［ES]，酶促反应达到最大速率 ，则： 米氏方程

当[S]Km时，v=Vmax/Km[S] 米氏常数是当酶反应速率达到最大反应速率的一半时的底物浓度。 因此,米氏常数的单位为mol/L。

2.动力学参数的意义 （1）米氏常数的意义 ①Km是酶的一个重要的特征常数。 只与酶的性质有关，而与其浓度无关。Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。 Km值可用来鉴别酶。 ②Km值可以判断酶的专一性和天然底物。 有的酶可作用于几种底物，因此有几个 Km 值，同一种酶有几种底物就有几个Km值，其中Km值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物。1/Km值可近似地表示酶对底物亲和力的大小， 1/Km值大表示亲和程度大，酶的催化活性低; 1/Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。 可判断酶的专一性。

特例： Km=K2/K1=Ks(在K3K2时) 所以1/Km表示形成ES的趋势大小 特例： Km=K2/K1=Ks(在K3K2时) ③Km与Ks Km不等于Ks 。在K3<<K1、K2时， Km看作Ks，也只有此时1/Km 才可以近似表示酶与底物结合的难易程度。

④若已知某个酶的Km值，可以计算在某一个底物浓度时，反应速率相当于最大反应速率Vmax的百分率。 如：[S]=3Km时，根据： 则： ⑤Km可以帮助推断某一反应的方向和途径

A.判断可逆反应方向的效率，了解其主要催化方向 肌酸+ATP 磷酸肌酸+ADP Km (mol/L) B.可推断连锁反应的限速步骤 Km ( mol/L） 酶1 10-2 酶2 10-3 酶3 10-4 Km小的酶促反应比较占优势

丙酮酸 Km=1.7x10-5mol/L 乳酸 Km=1.3x10-3 mol/L 乙酰CoA Km=1.0x10-3mol/L 乙醛 乳酸脱氢酶 丙酮酸脱氢酶 乙酰CoA 丙酮酸脱羧酶 Km小的酶促反应比较占优势 乙醛

（2）Vmax和 的意义 在一定酶浓度下，酶对特定底物的Vmax也是一个常数。同一种酶对不同底物的Vmax 也不同，pH、温度和离子强度等因素也影响Vmax 的数值。 当[S] 很大时， 成线性关系，而直线的斜率为 ，为一级反应速率常数，它表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，这个常数又叫做转换数（简称TN），通称为催化常数 。 值越大，表示酶的催化效率越高。

米氏方程

3. 利用作图法测定Km和Vmax 1 Km 1 1  =    +  V Vmax [S] Vmax

a.双倒数作图法 (Lineweaver-Burk) 斜率=Km/Vmax -1/Km 1/Vmax

b. v-v/[S]作图法 (Eadie-Hofstee) 将米氏方程改写： Vmax Vmax/Km

c.Hanes-Woolf作图法 1 Km 1 1  =    +  V Vmax [S] Vmax

d. Eisenthal和Cornish-Bowden直接线性作图 将米氏方程改写为：

（三）多底物的酶促反应动力学 1.酶促反应按参加的底物数目来分 2.按动力学机制来分 分单底物、双底物和三底物反应，最重要的是双底物反应。 2.按动力学机制来分 （1）序列反应——底物的结合和产物的释放有一定的顺序，产物不能在底物完全结合前释放。A和B两底物均结合到酶上，然后反应产生两产物P和Q。 序列反应分两类：有序反应和随机反应

①有序反应——底物按照一定的顺序与酶结合，形成三元复合物，然后按照一定的顺序释放反应的产物。 需要NAD或NADP的脱氢酶属于这种类型，这些脱氢酶的一般反应为： 优先底物A 随后底物B 随后产物Q 优先产物P

以乙醇脱氢酶为例： 底物B 底物A AEB PEQ 产物Q 产物P

②随机反应——两底物随机地与酶结合，形成三元复合物，产物的释放也是随机的。

以肌酸激酶为例： 肌酸（Cr） + ATP 磷酸肌酸+ADP

（2）乒乓反应——酶与领先底物A的反应产物（P）在酶与第二个底物B反应之前释放出来，结果酶E转变为一种修饰酶形式E’，然后再与底物B反应生成第二个产物Q，同时释放出未被修饰的酶E。 氨基转移酶属于这类作用机制

谷氨酸：天冬氨酸氨基转移酶

双底物反应的动力学方程 （1）乒乓机制的动力学方程和动力学图 对上式取双倒数，得下式：

（2）序列机制的动力学方程和动力学图 对上式取双倒数，得下式：

三.酶的抑制作用 ۝抑制作用与抑制剂 （抑制剂对酶反应速度的影响） 凡使酶的活性降低或丧失，但并不引起酶蛋白变性的作用称为抑制作用（inhibition）。 能够引起抑制作用的化合物则称为抑制剂(inhibitor)。（抑制剂不同于变性剂） (一) 抑制程度的表示方法 加入抑制剂后的反应速率 不加抑制剂时的反应速率

(二) 抑制作用的类型 包括不可逆抑制作用（irreversible inhibition)和可逆抑制作用(reversible inhibition)。 　 1. 不可逆抑制作用（irreversible inhibition) 抑制剂与酶蛋白中的必需基团以共价键形式结合，引起酶的永久性失活,不能用透析或超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶活性。 专一性不可逆抑制作用：这类抑制剂只作用于与酶活性部位有关的氨基酸残基或一类酶。 非专一性不可逆抑制作用：这类抑制剂作用于酶分子上不同的基团或作用于几类不同的酶。如：酰化剂酸酐和磺酰氯等可使酶蛋白的-OH、SH、NH2等发生酰化。

竞争性抑制(competitive inhibition) 非竞争性抑制(noncompetitive inhibition ) 2. 可逆抑制作用(reversible inhibition) 抑制剂与酶蛋白以非共价键方式结合，引起酶活性降低或暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类 竞争性抑制(competitive inhibition) 非竞争性抑制(noncompetitive inhibition ) 反竞争性抑制(uncompetitive inhibition )

（1）竞争性抑制(competitive inhibition) 某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竞争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。 竞争性抑制通常可以通过增大底物浓度， 即提高底物的竞争能力来消除。

竟争性抑制作用的例子：

（2） 非竟争性抑制(noncompetitive inhibition ) 酶可同时与底物及抑制剂结合，即底物和抑制剂没有竞争作用。酶与抑制剂结合后，还可与底物结合；酶与底物结合后，也可再结合抑制剂，但是三元的中间产物不能进一步分解为产物，所以酶活性降低。 如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg+、Pb2+等）通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制；EDTA结合金属离子引起的抑制作用也属于非竞争性抑制。 非竞争性抑制剂与酶活性中心以外的基团结合。这类抑制作用不会因提高底物浓度而减弱

（3） 反竞争性抑制(uncompetitive inhibition ) 酶只有与底物结合后才与抑制剂结合，从而导致酶活性下降。这类抑制作用最不重要。

（三）可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别 1.物理方法 用透析、超滤或凝胶过滤等物理方法区别。 2.动力学方法 ①在测定酶活力的系统中加入一定量的抑制剂，然后测定不同酶浓度的反应初速率。

②在测定酶活力的系统中加入不同浓度的抑制剂，然后测定不同酶浓度的反应初速率。

（四）可逆抑制作用动力学 1. 竞争性抑制 加入竞争性抑制剂后，Km 变大，酶促最大反应速度不变。

2.非竞争性抑制 加入非竞争性抑制剂后，Km 不变，而Vmax减小。

3.反竞争性抑制 加入反竞争性抑制剂，使Km和Vmax均减小

（五）一些重要的抑制剂 1.不可逆抑制剂 （1）非专一性不可逆抑制剂 ①有机磷化合物—与酶活性直接有关的丝氨酸上的-OH牢固地结合，从而抑制某些蛋白酶或酯酶。（DFP、敌百虫、敌敌畏、农药1605等）

这类化合物又叫神经毒剂 抑制 胆碱酯酶 乙酰胆碱 乙酸+胆碱 可用解磷定（碘化醛肟甲基吡啶）或氯磷定（氯化醛肟甲基吡啶）解毒

②有机汞、有机砷化合物—与酶蛋白上的-SH作用，从而抑制含-SH酶的活性。这类抑制作用可加入过量的巯基化合物（如半胱氨酸或还原型谷胱甘肽GSH）解除。 如，对氯汞苯甲酸 有机砷化合物如路易斯毒气作用机制

③重金属盐——如Ag+、Cu2+ 、Hg2+、Pb2+、Fe3+等在高浓度时能使大多数酶失活，低浓度时起抑制作用，加入金属螯合剂EDTA、半胱氨酸等可以解除。 ④烷化剂——如碘乙酸、碘乙酰胺、2，4-二硝基氟苯等能使酶蛋白中的 –SH、-NH2、-OH、-COOH、咪唑基等发生烷基化， 使酶失活。 ⑤氰化物、硫化物、CO—与含铁卟啉的酶中的Fe3+结合，使酶失活。 ⑥抗菌素类药物，与糖肽转肽酶活性部位Ser-OH共价结合，使酶失活，该酶在细菌细胞壁合成中使肽聚糖链交联，使细菌细胞壁合成受到阻碍，从而起到抗菌作用。

，该酶 （2）专一性不可逆抑制剂 ① Ks型不可逆抑制剂 这类抑制机可分为Ks型和Kcat型两大类 这类抑制剂与酶的底物结构类似，可以和相应的酶结 合，同时还带有一个活泼的化学基团，能与酶活性中心基 团反应进行化学修饰，从而抑制酶活性。因抑制是通过对 酶的亲和力来对酶进行修饰标记的，又叫亲和标记试剂 （affnity labeling reagent)。 由于这类抑制剂的活泼基团也可以修饰酶分子其他部 位的同一基团，因此其专一性有一定的限度。这取决于抑 制剂与活性部位必需基团在反应前形成非共价络合物的解 离常数以及非活性部位同类基团形成非共价络合物的解离 常数之比，即Ks的比值，故这类抑制剂称为Ks型不可逆抑 制剂。 ，该酶

例如胰蛋白酶：活性中心有一个催化必需基团His57。 底物 底物类似物

例如β-卤代-D-Ala是细菌中丙氨酸消旋酶（AR）的Kcat型不可逆抑制剂,属于以磷酸吡哆醛为辅酶的酶类的自杀性底物。 Kcat型抑制剂不但具有与天然底物类似的结构，而且本身也是酶的底物。还有一个潜伏的反应基团，当酶对这类抑制剂进行催化反应时，该潜伏反应基团被暴露或活化，又作用于酶活性中心的有关基团，使酶不可拟失活。即底物需经过酶催化之后，才能形成酶的不可逆抑制剂，因此，称之为“自杀性底物”（suicide substrates）。 例如β-卤代-D-Ala是细菌中丙氨酸消旋酶（AR）的Kcat型不可逆抑制剂,属于以磷酸吡哆醛为辅酶的酶类的自杀性底物。 AR L-Ala D-Ala

磷酸吡哆醛

2.可逆抑制剂 在可逆抑制剂中最重要的是竞争性抑制剂。大多数竞争性抑制剂与酶催化的天然代谢物在结构上十分相似，能选择性地抑制病菌或癌细胞在代谢过程中的某些酶，而具有抗菌和抗癌作用。这类抑制剂可称为抗代谢物或代谢类似物。例如： ①5′-氟尿嘧啶（5′- FU）抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶。 尿嘧啶脱氧核糖核苷酸 胸腺嘧啶核苷酸 胸腺嘧啶核苷酸合成酶 DNA

②磺胺类药物：以对氨基苯磺酰胺为例说明磺胺药物的作用机制。 人可利用外源叶酸，而细菌则不能！ 叶酸（外源） 对氨基苯磺酰胺 二氢叶酸还原酶 抑制 二氢叶酸合成酶 对氨基苯甲酸 二氢叶酸还原酶 二氢叶酸 四氢叶酸 嘌呤核苷酸合成途径中的辅酶

③过渡态类似物 腺嘌呤核苷——小牛肠腺苷脱氨酶 腺苷五磷酸——腺苷酸激酶（催化ATP+AMP 2ADP） 草酸——乳酸脱氢酶、草酰乙酸脱羧酶、丙酮酸羧化酶 （乳酸、草酰乙酸、丙酮酸共有的过渡态是烯醇式丙酮酸，草酸是烯醇式丙酮酸的结构类似物）

四. 温度对酶反应的影响 一方面是温度升高,酶促反应速度加快(温度系数Q10：反应温度提高10 C，其反应速度与原来的反应速度之比)。 另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。 因此大多数酶都有一个最适温度。 在最适温度(optimum temperature )条件下,反应速度最大。 酶对温度的耐受力与其存在状态有关。

五. pH 的影响 在一定的pH 下, 酶具有最大的催化活性,通常称此pH 为最适 pH(optimum pH)。 各种酶在一定条件下都有其特定的最适pH，因此最适pH是酶的特性之一。但酶的最适pH不是一个常数，受许多因素影响，随底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度的不同而改变，因此最适pH只有在一定条件下才有意意义。、大多数酶的最适pH在5-8之间。动物体的酶多在pH 6.5-8.0之间，植物及微生物中的酶多在pH4.5～6.5左右。

pH影响酶活力的原因有以下几个方面： （1）过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏。引起酶构象的改变，酶活性丧失。 （2）当pH改变不很剧烈时，酶虽然末变性，但活力受到影响。pH影响了底物的解离状态，或使底物不能和酶结合，或者结合后不能生成产物； pH影响酶分子活性部位上有关基团的解离，从而影响与底物的结合或催化，使酶活性降低；也可能影响到中间络合物ES的解离状态，不利于催化生成产物。 （3） pH影响维持酶分子空间结构的有关基团解离，从而影响了酶活性部位的构象，进而影响酶的活性。 由于酶活力受pH的影响很大，因此在酶的分离纯化时要选择酶的稳定pH，通常在某一pH缓冲液中进行。

六.酶浓度对酶反应速度的影响 Vmax=K3[E]  [E] 酶浓度对反应速度的影响

凡能提高酶活性的物质，都称为激活剂（activator）。 七.激活剂对酶反应速度的影响 凡能提高酶活性的物质，都称为激活剂（activator）。 （1）无机离子：金属离子(K+ Na+ Mg2+ Zn2+ Fe2+ Ca2+)、阴离子(Cl- Br-)、氢离子 （2）小分子有机化合物：某些还原剂（如半胱氨酸、GSH等）、乙二胺四乙酸（EDTA） (3)某些酶类：酶原激活过程中的酶类