乙型肝炎疫苗 姓 名：吕灵娟 学号：2012207353

一 乙型肝炎 乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒（HBV）感染机体后所引起的疾病。 简称“乙肝” 一 乙型肝炎 乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒（HBV）感染机体后所引起的疾病。 简称“乙肝” 乙型肝炎病毒是一种嗜肝病毒，主要存在于肝细胞内并损害肝细胞，引起肝细胞炎症、坏死、纤维化。 乙型病毒性肝炎分急性和慢性两种。

乙肝的主要传播途径是 通过血传播：输入血液或血液制品、采血及操作被乙肝病毒污染的医疗器械； 母婴传播，胎盘、分娩、哺乳、喂养等； 性接触传播； 日常生活接触传播，如学校、家庭、部队生活中密切接触传染。

2011年全国发病/死亡前10位病种

乙肝为何难治？ 乙肝病毒两层结构 病毒隐匿在肝细胞里面复制 病毒有一个复制模块 病毒会变性、变异 病毒会与人体基因产生链接 病毒生命周期是90天

二 治疗与预防 治疗 2009年以后三大肝病突破性技术先后研发成功。最早的是日本中微子透析技术；紧随其后，德国O3技术也震撼性问世；2011年末，我国上海复旦大学研究的治疗性疫苗（乙克）也宣告三期临床试验效果显著。

预防 接种乙肝疫苗（HepB）是一种有效而安全的预防措施，乙肝疫苗被注入人体后，可刺激免疫系统产生保护性抗体（抗—HBs），当乙肝病毒入侵时，体内的抗—HBs便与病毒中的乙肝病毒抗原（HBsAg）特异性结合，发生一系列的体液及细胞免疫反应，从而阻止病毒入侵肝细胞

乙肝疫苗的剂型：主要是针剂 注射方式： (1)注射部位为上臂三角肌肌内。 (2) 新生儿第1针在出生后24小时内注射，1个月及6个月后注射第2、3针;其他人群免疫程序为第0、1、6个月，剂量均为5ug/支

三 乙肝疫苗的种类 1、血源乙肝疫苗 2、基因工程乙肝疫苗 用无症状的HBsAg携带者的血液制成 三 乙肝疫苗的种类 1、血源乙肝疫苗 用无症状的HBsAg携带者的血液制成 2、基因工程乙肝疫苗 利用基因工程研制重组DNA乙肝疫苗，曾先后研制过大肠杆菌系统、啤酒酵母细胞系统、哺乳动物细胞系统和牛痘病毒系统的重组乙肝疫苗。 根据生产系统：（酵母、CHO细胞） 啤酒酵母乙肝疫苗（酿酒酵母、酵母） 汉逊酵母乙肝疫苗 毕赤酵母乙肝疫苗 CHO细胞乙肝疫苗

现有的国产及进口基因重组乙肝疫苗 生产单位 疫苗名称(种类) 剂型 国内 大连汉信 重组乙肝苗（汉逊酵母） 10μg/0.5ml/支 天坛生物 重组乙肝苗（酿酒酵母） 5μg/0.5ml/支 10μg/1.0ml/支 20μg/1.0ml/支 华药金坦 重组乙肝苗（CHO） 深圳康泰 60μg/1.0ml/支 北京华尔盾 10μg/支 20μg/支 进口 益可欣 20μg/ml 葛兰素史克 联合疫苗 北京科兴 倍尔来福 HA 500 EI.U.+ HB 10mg/1ml HA 720 EI.U.+ HB 20mg/1.0ml

3、含前S蛋白的乙肝疫苗 目前临床上应用的血源性疫苗与基因工程疫苗，均只含HBsAg蛋白。当证实S蛋白能增强HBsAg的免疫应答后，又注意到单纯只含HBsAg蛋白的疫苗对血液透析病人与新生儿免疫效果较差时，遂生产出添加前S蛋白的酵母源性重组乙肝疫苗，它确能明显地增强免疫应答。

1.血源乙肝疫苗 它的制备步骤大致是：采用高滴度HBsAg阳性携带者血液，分离出血浆并除去其中有感染的HBV颗粒后，再将HBsAg予以浓缩与纯化，充分灭活，以消灭其中可能存在的一切已知病毒和消除HBsAg表面可能存在的全部宿主蛋白，然后添加佐剂及防腐剂而成。

此种疫苗的免疫原性与安全性均已获得解决，但尚有一些缺点： ① 严格、复杂且费时的物理与化学方法纯化HBsAg抗原与灭活措施，使制备成本提高而疫苗产量不高； ②随着乙肝疫苗长期而广泛的使用，无症状HBsAg携带的数目势必逐渐 减少，最终将难以再用他们的血液制备疫苗

2.基因工程乙肝疫苗 重组酵母乙肝疫苗 重组基因工程乙肝疫苗（CHO细胞）

重组酵母乙肝疫苗 利用现代基因工程技术，构建含有乙肝病毒表面抗原基因的重组质粒，经此重组质粒转化的酵母能在繁殖过程中产生乙肝病毒表面抗原，经破碎酵母菌体，乙肝病毒表面抗原释放经纯化、灭活加佐剂氢氧化铝制成乙肝疫苗

重组CHO细胞乙肝疫苗 1 采用基因工程技术将无传染性的乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的S基因片段克隆到载体 2 3 收集分泌液，经高速离心、纯化、除菌后，加入佐剂制成

CHO细胞属哺乳动物细胞类，它是基因工程表达系统中最高等的宿生细胞，其表达产物更接近于天然产品。 优点：适合人体吸收，安全性好，免疫力持久

3.含前S蛋白的乙肝疫苗 这种疫苗是含有preS1、 preS2和S抗原的中蛋白或大蛋白疫苗。 HBV preS1含有肝细胞结合位点（aa21-47），preS2含有多聚人血清白蛋白（pH-SA）结合位点（aa120-146），都富有B细胞和T细胞表位。这种优势结构使它进入机体后能尽快地、有针对地与B细胞、T细胞结合，既增强体液免疫，又增强细胞免疫。

四 重组CHO细胞生产乙肝疫苗 1.CHO-C28细胞株种子细胞培养 （1）消化细胞：将形成致密单层细胞，用胰酶消化成疏松状态，加生长液吹打均匀。 （2）细胞培养：将细胞悬液按一定比例接种15L转瓶，加生长液摇匀，放37℃培养。形成单层后，每2天换1次维持液，收获含HBsAg原液。

2.CHO-C28细胞原液的培养 （1）细胞传代：利用血清的培养基，对CHO-C28细胞株种子细胞进行传代，连续传三代。 （2）细胞培养：加入0.25%胰酶消化，待细胞呈松散状态弃去胰酶，加入生长液，接种、收液，并用RPHA法测定培养液的HBsAg滴度。 （3）细胞观察：利用显微镜观察细胞的生长情况。

3.HBsAg的粗提 3.1 材料、设备 离心机 均质机 收液罐 pH计 电子天平 管式离心机、紫外分光光度计 分析天平 硫酸铵 超滤柱（截留分子量为10万） 溴化钾 不锈钢槽

3.2 实验步骤 将上一步细胞培养液通过管道打到收液罐中，再用截留分子量为10万的超滤柱进行浓缩。 向浓缩液中按一定比例加入硫酸铵，用搅拌机进行充分搅拌，沉淀一周左右，除去上清保留沉淀。 用低速离心机在低温下进行30分钟的离心，取沉淀加入溴化钾反复离心萃取，取上清。

4 密度梯度离心 4.1 材料、设备 超速离心机 紫外监测仪 溴化钾 超滤器 恒流泵 紫外检测仪 氯化钠 4.2 实验步骤 4 密度梯度离心 4.1 材料、设备 超速离心机 紫外监测仪 溴化钾 超滤器 恒流泵 紫外检测仪 氯化钠 4.2 实验步骤 超滤：用生理盐水冲洗超滤器至膜上下中性，超滤样品将其浓缩 冲洗：用生理盐水冲洗超滤膜，将蛋白冲下，合并到浓缩液中，加溴化钾调比重至1.32g/mL 密度梯度离心：KBr梯度离心

5 层析纯化 5.1 材料、设备 紫外检测仪 便携式记录仪 蠕动泵 双门层析冷柜 层析柱 XDF-GM疏水柱 NaAC HAC 5.2 实验步骤 Sepharose44FF亲和层析纯化 将KBr离心提取的样品经6mol/L NaOH调节pH7.0后上亲和层析柱，收集A280

6 结果检测 测纯度 SDS-PAGE 效价测定 热源 DNA残留量 HPLC