第七节 水稻育种的途径和方法（四） ---分子标记辅助选择和转基因育种 第七节 水稻育种的途径和方法（四） ---分子标记辅助选择和转基因育种

一、分子标记辅助选择育种 传统育种是通过目标性状的表现型对基因型进行间接选择。分子标记辅助选择（Marker-assisted selection,MAS) 是利用与目标性状基因紧密连锁的标记对基因型进行间接选择。

与传统的表现型选择相比，MAS的优点： 1、不受等位基因间显隐性关系、其他基因效应和环境因素的影响，选择结果可靠。

2、可在植株生长发育前期和育种早代时期进行选择，提高选择效率和缩短育种年限。

（一）分子标记辅助选择的基本原理 首先，通过基因定位或QTL分析，获得与目标性状基因或QTL连锁的分子标记。 （什么是标记？）

图1 引物RM5629对5个杂交组合F1及其亲本的扩增带型 　　200bp 　　300bp 100bp 110bp 　　　120bp 图1 引物RM5629对5个杂交组合F1及其亲本的扩增带型 1=863A ；2=863B；3=86优8 ；4=宁恢8号, 5=9522A；6=9522B；7=常优1号；8=R254；9=六千辛A ；10=六千辛B；11=六优一号；12=77302-1；13=泗稻8号A；14=泗稻8号B ；15=泗优422；16=LH422；17=03A；18=03B；19=3优18；20=C418. M：梯度为100 bp的DNA大小标记

办法是：通过构建包含目标性状分离群体（F2群体、回交群体、DH群体或RIL群体）和连锁分析，获得与目标性状基因连锁的共显性分子标记。

基于PCR 技术的分子标记，如SSR标记、SCAR标记、CAPS标记、STS标记等，是较理想的适用于辅助选择的分子标记。

然后，利用分子标记对目标基因型进行辅助选择。 这是通过对分子标记基因型的检测间接选择目标基因型。 分子标记与目标基因的连锁越紧密，选择效率越高。

有研究表明，若要选择效率达90%以上，则标记与目标基因间的重组率必须小于0.05。 同时用两侧相邻的两个标记对对目标基因进行选择,可大大提高选择的准确性。

在回交育种程序中，除了对目标基因进行正向选择（前景选择）外，还可同时对轮回亲本的遗传背景进行选择（背景选择）。

（二）不同目标性状类型的分子标记辅助选择效率 对于质量性状： 在多数情况下，没有必要借助分子标记辅助。但在以下几种情况下，利用标记辅助选择可提高选择效率。

①表现型测定在技术上难度较大或费用很高，如抗病虫性。 ②表现型只在个体发育后期才能测量。 ③目标性状由隐性基因控制，在杂合世代不表现。 ④回交转育过程中，还需同时对背景进行选择。

对于多基因控制的数量性状： 对多基因选择不但技术上更复杂，成本更高，而且由于每个QTL的贡献率较小，效率也更低。 但一旦建立起QTL与分子标记的连锁关系，就有希望利用MAS进行改良。

借助分子标记对QTL进行辅助选择的成败 主要取决于对QTL的精确定位以及QTL受环境因素和其他基因型影响的大小。

目前对QTL的分析在相当大的程度上还是建立在样本较小、 实验精确性较低、 统计分析未考虑上位性效应 的基础上，仍需完善方法及其应用软件，从而更精确地估计QTL对表现型的贡献率。

（三）分子标记辅助选择在水稻育种上的应用实例 Abenes et al(1993) IR24近等基因系IRBB21（含Xa-21）与IR24杂交，用与Xa-21连锁的STS标记（pTA248)检测得到34株纯合抗性植株。

以常规接种方法检测F2:3株系以确定F2植株的基因型，结果为31株纯合抗病，仅3株为杂合抗病，准确率为91.2%。 已知pTA248与Xa-21的遗传距离为1.2cM,近9%的误差反映了选择群体和定位群体之间的重组频率的变化。

Huang et al (1997)利用MAS将4个抗白叶枯病基因Xa-4、xa-5 、xa-13 和Xa-21聚合到IRBB60中。

（四）分子标记辅助选择应用前景 1、应用于有用基因的聚合育种 聚合育种就是将分散在不同品种中的有用基因聚合到同一个品种中。是抗病虫育种的一个重要育种目标。

抗性鉴定需要人工接种（虫）， 必须在一定的发育时期进行， 要求严格控制接种（虫）条件， 而且在聚合过程中，必须对不同的抗性基因分别进行鉴定，技术上较为困难。 利用MAS就可避免上述困难。

2、应用于回交育种 利用MAS技术对目标基因进行正向选择的同时，对轮回亲本的遗传背景进行选择，可加快核置换进度。 这是传统育种手段所无法比拟的。

3、应用于数量性状的分子标记辅助选择 利用回交高代QTL分析方法（Tanksley, 1993），可以建立一套受体亲本的近等基因系，其遗传背景来自受体亲本，仅个别染色体片段来自供体亲本。

Bernacchi et al(1998)用上述策略将番茄野生种中与果实性状有关的有利等位基因转入优良的番茄品种中。 利用这些近等基因系就可以对有关QTL进行精细定位，大大提高数量性状MAS的可靠性。 Bernacchi et al(1998)用上述策略将番茄野生种中与果实性状有关的有利等位基因转入优良的番茄品种中。

为使基因定位研究成果尽快服务于育种，应注重基因定位群体与育种群体相结合。 因为： 不同群体的目的基因与标记之间的遗传距离往往不一致，当基因与标记之间相距较远时，不同群体之间差异就较大，定位结果达不到标记辅助选择育种应用的要求。

二、转基因育种 转基因育种就是将转基因技术与常规育种手段相结合，培育具有特定目标性状的新品种。

转基因育种涉及目的基因的克隆、载体的构建、转基因植株（遗传工程体）的获得及其在育种实践中的应用等多个过程。

转基因育种的优点： 1、可利用的基因资源范围广。外源基因可以来自植物、动物或者微生物。

2、具有定向变异和定向选择的特征。可提高选择效率和加快育种进程。 3、可作为生物反应器生产药物等生物制品。如日本科学家将乙肝病毒抗体基因导入水稻，利用稻叶提取乙肝疫苗。

（一）目的基因的种类 抗虫基因（如Bt)； 抗病基因（如 Xa-21 ）； 提高品质的基因。

（二）常用载体和水稻受体系统 已经分离的目的基因一般都保存在大肠杆菌内的一类辅助质粒中，常用的有pBR322系列、pUC、pBluescript K+(-)系列等。

在进行外源基因转移前还必须将外源基因重组到合适的转化载体上，具体采用哪种载体要根据转基因的方法和目的而定。

受体是指用于接受外源DNA的转化材料。 建立稳定、高效和易于再生的受体系统，是植物转基因操作的关键技术之一。 良好的植物基因转化受体系统应满足以下条件：

①高效稳定的再生能力。 ②有较高的遗传稳定性。 ③具有稳定的外植体来源。 ④对筛选剂敏感。

目前水稻受体材料系统存在的主要问题有： 再生率低； 基因型依赖性强； 再生细胞部位与转化部位不一致等。

（三）转基因方法 分两类： 1、以载体为媒介的遗传转化（也称间接转化）。

原理： 通过载体携带将外源基因导入植物细胞并整合在染色体组中，随着核染色体一起复制和表达。 农杆菌Ti质粒或Ri质粒介导法是应用最多的方法。

2、外源目的DNA的直接转化 基因枪法， 电击法， 超声波法， PEG介导法， 显微注射法等。 以上方法，由于种种原因，实际应用受到限制。

（四）转化体的筛选和鉴定 1、转化体的筛选 目的基因被整合到核基因组并实现表达的转化细胞非常稀少。要有效地选择出这些转化细胞，就有必要使用特异性的选择标记基因进行标记。 常用的选择标记基因有抗生素抗性基因和除草剂抗性基因两大类。

前者如： 卡那霉素抗性基因nptII和潮霉素抗性基因hpt。 后者如： 除草剂抗性基因bar基因和草甘膦（Glyphosate）抗性基因。

在实际工作中，是将选择标记基因与适当的启动子构成嵌合基因并克隆到质粒载体上，与目的基因同时进行转化。

当标记基因被导入受体细胞后， 就会使转化细胞具有抵抗相关抗生素或除草剂的能力， 在抗生素或除草剂存在的环境中非转化细胞被抑制、杀死，转化细胞则能够存活下来。

2、转化体的鉴定 上面筛选得到的抗性植株只能初步证明标记基因已经整合进入受体细胞，至于目的基因是否整合、表达还无从判断。因此，还必须对抗性植株进一步检测。

根据检测水平的不同，可分为： DNA水平、 转录水平、 翻译水平、 的鉴定。

DNA水平的鉴定主要是检测外源目的基因是否整合进入受体基因组，整合的拷贝数以及整合的位置。 常用的检测方法主要有特异性PCR检测和Southern杂交。

转录水平的鉴定是对外源基因转录形成mRNA情况进行检测。 常用的方法主要有Northern杂交和RT-PCR检测。

翻译水平或蛋白质水平鉴定主要是检测外源基因转录形成的mRNA能否翻译成蛋白。 最主要的方法是Western杂交。

1、通过转基因获得的植株只能作为育种的中间材料。 （五）转基因水稻育种及生物安全性 1、通过转基因获得的植株只能作为育种的中间材料。 因为：外源基因导入只是赋予了特定的目标性状，其他目标性状是否符合生产需要还不清楚；外源基因的插入可能使原有基因组结构发生了改变，对宿主基因的表达产生影响。

成功的例子有： 1、Golden rice (Syngenta); 2、大豆铁蛋白导入水稻，胚乳铁蛋白含量提高了3倍（英国）。 3、Bar基因导入水稻，抗除草剂（中国黄大年）

2、转基因作物的生态安全和食用安全 生态安全性关注的焦点是： 转基因作物是否会转变为杂草、 转基因漂流是否会导致新型杂草产生、 转基因作物是否会导致新型病原体产生、 转基因作物是否会对生态系统中的非靶标生物造成伤害等。

食品安全性关注的焦点是： 抗生素标记转基因是否会在人体内水平转移而导致新致病菌的产生； 外源基因（及其产物）是否有害于消费者的健康。

科学工作者正在努力开发各种切实可行的具有安全性的转基因途径，力求将转基因作物可能带来的风险降低到最低水平。

第八节  水稻育种试验技术 一、试验地 1 土地平坦, 保水性良好, 水源方便, 灌排设施齐全。 2 务求连片，按需划块，各有田埂，灌排独立。 3 注意轮作，培养地力；道路设施须便于工作和运输，提高效率。

二、世代群体的种植 1 F1代：种子若当年播种，要用50-550C温度处理72-120小时以打破休眠。 剪颖授粉产生的F1种子，播前要去壳，消毒催芽。种子消毒可用0.1%的升汞处理10分钟。

二、世代群体的种植 1 F1代：种子若当年播种，要用50-550C温度处理72-120小时以打破休眠。 剪颖授粉产生的F1种子，播前要去壳，消毒催芽。种子消毒可用0.1%的升汞处理10分钟。 直接播入秧田易霉烂，故须提高秧田耕整质量。若用秧盘育秧，须进行育秧土的消毒。F1代单苗移栽，混合收获，产生F2。

2 F2代：育秧移栽，落谷要稀，培育壮苗，以利于提高插秧质量，并可减轻查苗补缺的工作量。 单苗插秧,按组合排列， 可种或不种对照和杂交亲本。 株行距放宽，以利于不同基因型个体良好发育，提高选择效果。 F2群体大小视杂交组合性质和育种目标而异。单株选择。

F3代： 将上年（季）当选单株种成株系。 每个株系一小区。单株插植。每个株系一般种100株左右。 每10-20个小区种植一个对照品种。

从F3中选择优良株系，并继续在其中选株（穗），次年（季）种成同源的F4家系。 如此循序前进，直至选出优良株系，混收产生品系。进行品系鉴定试验。 从试验的早期起，抗病虫逆害和稻米品质的鉴定结合进行。

4 品系鉴定试验： 设对照、设重复、面积稍大。育秧移栽。 单苗或少苗插秧，单苗插便于继续选择，少苗插便于鉴定其生产性能。 优良品系进一步参加省、区多点鉴定试验。 然后推荐参加省、区或国家级的有重复的区域试验，优秀者经省、区或国家的品种审定委员会审定，给以命名推广。

三、杂交技术 1. 亲本种植：分期播种调节花期，每期播种相隔2-3周，播2-3期。精细管理使之生长良好。 2. 杂交场所：①直接在田间；②移栽到盆钵中；放置于避风而光照充足的场所。

3. 整穗。 4. 去雄。 ①43-45℃温水杀雄3~5分钟后，不论颖花开放与否，用尖头小剪刀斜剪颖花上部约1/4的颖壳，一并挑去花药，套好纸袋，等候授粉。挂牌。 ②真空吸雄法。用3/4马力的电动机抽气，吸除花药、套袋挂牌。

5. 授粉。柱头接受花粉发芽的能力可维持5天左右，一般以当天去雄或隔日授粉为好。人工授粉时须保证有足量新鲜的花粉。临盛花时要注意避风吹散花粉。

四、隔离 1 不育系的繁殖和杂种稻的制种，在抽穗期间田块四周相当距离内不应有别的稻种同时抽穗散粉。 2 繁殖区和制种区要互相隔离。 3 大规模的繁殖和制种在自然隔离区中集中进行，小规模的繁殖和制种可用人工屏障隔离， 如繁殖或制种田四周围以适当高度的塑料布。