核酸检测阳性结果的分析与追踪策略 山东省血液中心 2012.04

介绍内容 核酸检测概况 NAT检测情况分析 随访检测

血站与医院临床核酸扩增检测的差异 血 站 临床实验室 目 的 缩短检测“窗口期” 感染性疾病的诊断和治疗监测 测定下限 定性测定，越低越好 血 站 临床实验室 目 的 缩短检测“窗口期” 感染性疾病的诊断和治疗监测 测定下限 定性测定，越低越好 定性或定量测定 测定策略 单人份或多人份混合 单人份 技 术 PCR和TMA PCR+产物分析（测序、杂交等） 对标本制备的要求 对标本必须进行核酸纯化，且必须自动化 对核酸纯化要求低，多为手工操作 对加样量和反应体积的要求 应尽可能大，决定了检测的敏感性 稍低些（相对于血站） 服务对象 受血者 被检者

核酸检测工作概况 •检测样管：（5ml、8ml）EDTA-K2抗凝剂无RNA酶分离胶真空试管。 •标本离心时间：所有固定采血点（献血屋）配备水平离心机，2-4h内离心后2-8℃保存；流动采血车2～3h内取回站部检验科离心保存。 •检测模式： •NAT检测标本分配：

进一步鉴别检测（ROCHE） 应采用具有相应检测下限的试剂，对不能鉴别HBV、HCV和HIV检测反应性样本进行鉴别检测。

WB确证试验 献血日标本，无带型，结论为阴性。 •献血后第15天标本带型为gp160 p24 •第25天标本带型为gp160 gp120 p66 p55 gp41 p31 p24 p17，结论为HIV-1抗体阳性，证实为HIV感染者.

乙型肝炎的感染进程

HBsAg测定“阴性” 窗口期 隐匿性HBV感染：HBsAg检测为“阴性”,但在血循环或肝脏中可检出HBV DNA的HBV感染 12

阳性（反应性）样本的确认程序 混合检测阳性（反应性）标本 乙肝”两对半” 追踪献血员(1-2月)可同时检测特异抗原 抗HBe和/或抗HBc+ 再次检测核酸 阳性 送参比Lab验证 阴性 追踪献血员（1-2月后检测）“两对半”及核酸 确实不能追踪者 全阴 抗HBe和/或抗HBc+ HBV DNA HCV RNA HIV-1 RNA HBsAg+ 追踪献血员(1-2月)可同时检测特异抗原 乙肝”两对半” 混合检测阳性（反应性）标本 拆分阳性（反应性） 抗体（+） 仍全阴 抗体或抗原（—） 阳性（反应性）样本的确认程序 阳性 阴性 继续追踪献血员或送参比Lab验证 17

核酸检测献血者追踪随访意义 核酸检测特点与需求 关爱献血者 输血安全研究 核酸检测阳性结果确认要求 窗口期病毒标识物 献血者有“知情权”； 及时提醒进行治疗 输血安全研究 窗口期 病毒感染标识物 方法评估

追踪随访原则 知情同意与主动告知 NAT项目意义 检测结果解释 献血者隐私保密 个人信息、结果保密。 试验设计 规范管理

阳性追踪流程： 核酸混样检测筛查出阳性 并经拆分试验阳性 电话通知献血者 电话通知被追踪者 检测结果 记录结果、分析结果 短信告知详细地址 被追踪者来到单位， 采集血液，临床咨询。 标本分别进行 NAT、EIA、ECLA

核酸阳性追踪随访关键控制点 追踪时间 回访方式 样品采集 追踪试验 临床咨询与结果解释 数据分析

追踪回访时间 NAT试验特点 是否有鉴别试验结果 不同病毒感染后标志物变化曲线 拆分试验阳性、尽快通知献血者， 3天、7天、14天、30天

追踪回访时间 追踪时间：拆分试验阳性、尽快通知献血者，2～5天首次电话联系；15～30天再次联系，并通知追踪采样。 •追踪解释：对他感谢、目前国家规定方法检测合格、试点方法意义、试点方法结果、追踪随访意义，及时返回结果。

追踪回访方式 追踪方式 第一时间通知献血者 联系方法 电话回访 短信、QQ、EMAIL 私密性咨询、解释 追踪检测结果反馈

样品采集 样品采集要求 编码规则： 带分离胶EDTA抗凝真空采血管（2管8ml、2管5ml） 记录采集日期、样品编码等信息 由于追踪标本无法按照中心无偿献血的条码进行编号，特制定编码规则； 具体规则为：献血者最近一次的献血码的后八位前加上0和月日， 例如：献血码后八位为1000XXXX，追踪标本采集日期为2010.09.01，则编码为：009011000XXXX，以进行下面的实验。

追踪试验 试验项目 EIA：实验室常规检测HBsAg、anti-HCV、anti-HIV ECA：电化学发光检测乙肝“两对半”，anti-HCV、anti-HIV NAT：混样或者单检模式检测HBV、HCV、HIV核酸 生化项目：检测追踪样本ALT。

临床咨询与结果解释 电话通知时的咨询服务 首次追踪回访时咨询服务 追踪试验结果的反馈与解释

电话通知时的咨询服务 根据献血登记信息，电话联系。 电话告知内容 短信 言简意赅 我们的身份 检测结果 追踪目的、意义 提出要求 表示感谢 具体地址 办公电话

首次追踪回访时咨询服务 解释结果的意义 请献血员阅读《知情同意书》 被追踪者及采血者签字 注意交谈的语气、措辞 回答尽量明确、实事求是 告知献血者注意事项。

规范化管理 操作规程 制定《NAT阳性追踪操作规程》

图1. 《山东省血液中心核酸检测（NAT）阳性无偿献血者血样采集知情同意书》

图2. 《NAT阳性献血者采血纪录》

追踪实例 首次检测结果： 首次检测HBV、HCV、HIV，通过两遍酶免及电化学发光方法检测均显示正常，但核酸检测混样及拆分结果均为阳性，提示为明显的“窗口期”。

追踪实例 第一次追踪实验结果： 一周后，第一次追踪实验结果显示：单检模式联合检测HBV、HCV、HIV核酸，Ct值为30.1＜首次核酸检测阳性时单检的Ct值32.7，说明病毒拷贝数增多；电化学发光检测乙肝五项、anti-HCV、anti-HIV均为阴性。

追踪实例 第二次追踪实验结果： 第五周时，第二次追踪实验结果显示：混样模式联合检测HBV、HCV、HIV核酸，Ct值为23.4＜首次核酸检测阳性时单检的Ct值32.7，且小于第一次追踪时单检的Ct值30.1，更加说明病毒拷贝数增多；电化学发光检测发现HBsAg、HBeAg为阳性，提示为早期乙肝感染或者慢性乙肝病毒携带者，类似“大三阳”传染性强。 但此时酶免结果仍为阴性，说明酶免的灵敏度较电化学发光低。

追踪实例 第三次追踪实验结果： 第十二周时，第三次追踪实验结果显示：混样模式联合检测HBV、HCV、HIV核酸，Ct值为29.2＜首次核酸检测阳性时单检的Ct值32.7，且小于第一次追踪时单检的Ct值30.1，但大于第二次追踪时混样的Ct值23.4，说明病毒拷贝数较上次降低，但仍维持在较高水平；电化学发光检测发现只有HBeAb为阳性，提示乙肝病毒复制不活跃，传染性低或很少，是乙型肝炎病毒感染时间较长久的标志。若其长期存在，提示HBV-DNA和宿主DNA整合。但如果同时检出HBV-DNA阳性，说明血中仍存在乙肝病毒或病毒已变异，不仅具有传染性，而且对机体的危害可能更大。

小结 HBV NAT 无疑为血液安全提供了更好地保障 •血清学检测 和NAT 互补，不可互相替代 •依然有可能漏检 •导致OBI产生是多原因的，情况各不同 阳性追踪是核酸检测工作中重点 咨询服务与结果解释是追踪回访的关键