第8章:维生素的测定 Chapter 8 Analysis of Vitamin

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第8章:维生素的测定 Chapter 8 Analysis of Vitamin 浙江科技学院 生物与化学工程学院 刘铁兵 tbliu@126.com

食品分析 欢迎各位 同学和朋友! 刘 铁 兵 tbliu@126.com 浙江科技学院 生物与化学工程学院

概述 1)维生素对人体的作用: 维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有机化合物。其种类很多,目前已确认的有30余种,其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种。这些维生素结构复杂,理化性质及生理功能各异,有的属于醇类,有的属于胺类,有的属于酯类,还有的属于酚或醌类化台物。作为代谢的辅酶。

维生素都具有以下共同特点: 这些化合物或其前体化合物都在天然食物中存在;它们不能供给机体热能。也不是构成组织的基本原料,主要功用是通过作为辅酶的成份调节代谢过程,需要量极小;它们一般在体内不能合成,或合成量不能满足生理需要,必须经常从食物中摄取;长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病。 我们在评价食品的营养价值,开发利用高含量维生素的食品资源,指导人们合理调整膳食结构,指导制定加工工艺或贮存条件,最大限量地保留各种维生素,还要控制强化食品中加入量,防中毒,都离不开分析检测工作。

2)维生素的分类: 脂溶性维生素:A、D、E、K 水溶性维生素:B、C 3)维生素分析方法: 化学方法: 仪器方法: 微生物法: 生物鉴定法:

脂溶性维生素的测定 VA、VD、VE、与类脂物一起存于食物中,摄食时可吸收,可在体内积贮。 脂溶性维生素具有以下理化性质: 1.溶解性:脂溶性维生素不溶于水,易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。 2.耐酸碱性:维生素A、D对酸不稳定, 对碱稳定,维生素E对碱不稳定,但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下,也能经受碱的煮沸。

耐热性、耐氧化性: 耐热性 氧化性 VA 好,能经受煮沸 易被氧化 (光、热 促进其氧化) V D 好,能经受煮沸 不易被氧化 V E 好,能经受煮沸 在空气中能慢慢被氧化 (光、热、碱促进其 氧化)

根据上述性质.测定脂溶性维生素时,通常: 皂化样品 水洗去除类脂物 有机溶剂提取脂溶性维生素(不皂化物) 浓缩 溶于适当的溶剂 测定。 在皂化和浓缩时,为防止维生素的氧化分解,常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等)。 对于A、D、E共存的样品,或杂质含量高的样品,在皂化提取后,还需进行层析分离。 国际单位: IU (International Unit) 1 IU = 0.3μg VA = 0.025 VD = 1.79 μgβ-胡萝卜素 = 1.1mg α- VE = 3 μg VB

2、维生素A的测定 维生素A的结构: 视黄醇 脱氢视黄醇 高效液相色谱法测定食物中VA、VE(GB/T 5009.82—2003中第一法) 高效液相色谱法测定维生素A是近几年发展起来的方法,此法能快速分离和测定视黄醇和它的同分异构体、酯及其衍生物。此法是同时测定维生素A和维生素E的方法。

三氯化锑比色法测定VA (GB/T 5009.82—2003中第二法) 基本原理: 在氯仿溶液中VA能与三氯化锑生成蓝色可溶性络合物,在620nm有最大光吸收,其光吸收强度与VA浓度成正比。 适用范围与特点: 适用于高VA含量的食品;对低VA含量的食品因其它脂溶性成分的存在而受干扰;本法生成的蓝色络合物不稳定,比色必须在6秒内完成。 试剂: 无水乙醚:不含过氧化氢,检测方法:5ml乙醚加1ml10%碘化钾振1分钟,或再加4滴0.5%淀粉,水呈蓝色;去除方法:重蒸馏时,瓶内加入少许铁丝。

测定方法: 样品处理:脱脂,用皂化法;皂化----提取----洗涤----浓缩; 标准曲线绘制: 样品测定:反应在比色皿中进行。 注意事项: ★ 乙醇为溶剂的萃取体系,易发生乳化现象; ★ 所用氯仿中不应有水分,因三氯化锑遇水会出现沉淀,干 扰测定;故在每ml氯仿中滴加1滴乙酸酐,以保证脱水; ★ VA见光易分解,故整个操作要在暗处进行; ★ 每国际单VA相当于0.3ugVA。

注意事项: ★ 样品中的β-胡萝卜素会干扰测定,可将干样品用正已烷溶 解,以氧化铝为吸附剂,丙酮-已烷混合液为洗脱剂进行 层析分离; ★ 三氯化锑腐蚀性极强; ★ VA含量高的样品可直接加无水硫酸钠研磨后,加乙醚提 取,加三氯甲烷溶解后即为待测的处理样品; ★ 显色剂除用三氯化锑外,还可用三氟乙酸、三氯乙酸。

紫外分光光度法测定VA 基本原理: VA的异丙醇溶液在325nm有最大吸收峰,其吸光度与VA含量成正比; 适用范围与特点: 灵敏度高,检测下限为5ppm,但325nm吸收干扰物质多;因此只适合于透明鱼油、VA浓缩物等纯度较高的样品; 测定方法: 样品----皂化----洗脱---脱水----蒸发---异丙醇溶解---325nm测定光吸收;

胡萝卜素的测定 VA的前体物质:类胡萝卜素; α、β、γ胡萝卜素,其中以β-胡萝卜素的效价最高,每mg β -胡萝卜素相当于560国际单位VA。 胡萝卜素只存在于植物性食物中;胡萝卜素对热、酸、碱比较稳 定,但对紫外线和氧却不稳定,可将其破坏。 胡萝卜素在450nm有最大吸收;但由于其常与叶绿素、叶黄素等 色素共存,故要测定必须要分离出胡萝卜素。 通常用层析法分离测定胡萝卜素: 基本原理: 以丙醇、石油醚提取出胡萝卜素,以石油醚为展开剂进行纸层析,由于胡萝卜素的极性最小,移动速度最快,从而与其它色素分开,取下此区带,洗脱后于450nm比色测定。

β—胡萝卜素的结构如下: 胡萝卜素原只存在于植物性食品中,但以含有胡萝卜为食物的家禽、兽类、水产动物及其加工产品,以及为着色而添加胡萝卜素的食品,当然也含有胡萝卜素。

测定方法: 样品的提取与洗涤:注意植物油和高脂肪样品先要皂化; 样品的浓缩与定容:在有氮气环境中浓缩,但不要浓缩得太干; 纸层析: 点样:在基线(距低端4CM处)上取四点,分别在二点间 带状点样; 展开:以饱和过的石油醚为展开剂,进行上行展开; 洗脱:剪下胡萝卜素色带,置于5ml具塞试管中,用力振摇, 使色素完全溶解; 比色测定:以石油醚为空白,于450nm处比色测定; 标准曲线的绘制:

说明与讨论: ★ 此法为国标方法,方法简单、最小检出限为0.11ug; ★ 浓缩时要防止蒸干,同时要在充氮条件下进行; ★ 层析分离也可用柱层析,效果好,但费时; ★ 一般用专用的中速滤纸; (GB/T 5009.83—2003 )第一方法是HPLC;第二方法为纸层析法。

维生素D的测定 概述: 成人缺乏VD会患软骨病,儿童缺乏VD会患佝偻病;VD有多种,其中最重要的是VD2和VD3及其维生素D原,VD3只存在于某些动物性食物中。维生素D2无天然存在,维生素D2只存在于某些动物性食物中。但它们都可由维生素D原(麦角固醇和7一脱氢胆固醇)经紫外线照射形成。 1IU=0.025ugVD3 VD测定方法有:比色法、紫外分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法、薄层层析;比色法和HPLC法为AOAC推荐的VD测定方法。

三氯化锑比色法测定VD 基本原理: 在三氯甲烷溶液中,VD与三氯化锑结合生成一种橙黄色化合物,在500nm处的呈色强度与VD的含量成正比; 样品测定: 样品处理:当有VA与VD共存时,要进行分离,分离方法为: 制备分离柱:分四层,依次为无水Na2SO4、聚乙二醇层、中性氧化铝层和无水Na2SO4; 纯化:以石油醚为淋洗剂,弃去初滤液,收集一定量;然后用水三次洗以除去残余的聚乙二醇,避免与三氯化锑反应生成混浊物影响比色;然后再用无水硫酸钠脱水,之后用三氯甲烷溶解; 测定:绘制标准曲线:样品测定:

三氯化锑比色法测定VD 说明与讨论: ★ VD常与VA、VE、胆固醇等在一起,且量要大大超过VD, 严重干扰其测定,因此要经柱层析去除这些干扰成分; ★ 操作时加入乙酰氯可消除温度的影响; ★ 此法不能区分VD2和VD3,测定的是二者的总和;

维生素E的测定 概述: VE有八种,又称生育酚,属于酚类化合物;其中以α-生育酚的生理活性最高,分布也最广;动植物中均有分布,其中又以植物油料中为最多。 主要测定方法有:比色法、荧光法、气相色谱法、高效液相色谱法;比色法操作简单,灵敏度较高,但由于VE无特异性反应,要采取一些方法消除干扰;荧光法特异性强、干扰少、灵敏、快速、简单;目前测定VE最好的方法为HPLC法。

比色法测定维生素E 基本原理: VE能将Fe3+还原成Fe2+,而Fe2+能与联氮苯发生颜色反应,可于520nm比色测定; 测定操作: 样品处理:皂化:于KOH的甲醇溶液中皂化,并在充氮气流中72-74C皂化,然后加水乙醚萃取,再将萃取液经无水硫酸钠脱水;在二氧化碳气流中减压蒸干; 纯化:用苯作洗脱液进行柱层析,洗至洗出液约25ml;若柱上出现微蓝色带则为类胡萝卜素;出现暗蓝色带则为VA; 样品测定:FeCl3乙醇溶液、联氮苯乙醇溶液;放置10分钟;520nm; 标准曲线绘制:

说明与讨论: ★ VE在碱性条件下易被氧化,因此需在N2气流中皂化,并可加入 焦性没食子酸作为抗氧化剂; ★ 处理前应将其它可使三价铁还原为二价铁的还原性物质去除; ★ 发色剂除用联氮苯外,也可用4,7-二苯基-1,10-菲绕啉; ★ VE的各种异构体与试剂的反应速度、呈色强度各不相同; ★ VE见光易氧化,因此操作要避光。

水溶性维生素的测定 水溶性维生素B1、B2和C,广泛存在于动植物组织中,饮食来源充足。但是由于它们本身的水溶性质,除满足人体生理、生化作用外,任何多余量都会从小便中排出。为避免耗尽,需要经常地由饮食来提供。 水溶性维生素都易溶于水,而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定,既使加热也不破坏;但在碱性介质中不稳定,易于分解,特别在碱性条件下加热,可破坏大部分或全部。它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响; 维生素B2对光,特别是紫外线敏感,易被光线破坏; 维生素C对氧、铜离子敏感,易被氧化。

根据上述性质,测定水溶性维生素时,一般都在酸性溶液中进行前处理。 维生素Bl、B2 盐酸水解 酶解 提取 纯化 维生素C通常采用草酸、草酸—醋酸、偏磷酸—醋酸溶液直接提取。在一定浓度的酸性介质中,可以消除某些还原性杂质对维生素C的破坏作用。草酸价廉,使用方便,对维生素C有很好的保护作用。 淀粉酶 木瓜蛋白酶 活性人造浮石 硅镁吸附剂

维生素B1的测定 概述: VB1又名硫胺素,可与盐酸生成盐酸盐;通常以游离态,自然界常与焦磷酸结合成焦磷酸硫胺素(TPP)。在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛乳、蛋黄中含量较为丰富。VB1在机体代谢中具有重要作用,缺乏会引起脚气病、神经炎等。人体维生素B1的需要量为每天1~2mg。 主要测定方法有:分光光度法、荧光法、高效液相色谱法;GB/T 5009.84—2003中唯一的方法是荧光计法。

荧光法测定维生素B1 基本原理: VB1在碱性高铁氰化钾溶液中,能被氧化成一种蓝色的荧光化合物——硫色素,在没有其它荧光物质存在时,溶液的荧光强度与硫色素的浓度成正比。所含杂质需要用柱色谱法处理,测定提纯溶液中VB1的含量。 操作步骤: (1)样品处理: (2)提纯: (3)氧化: (4)标准与标准空白制备: (5)测定:

说明: (1)凡士林有荧光,因此活塞上不能涂,可用甘油-淀粉代替; (2)一般样品中VB1有游离也有结合型,故需要用酸和酶水解; (3)谷物类不需要酶分解,样品经粉碎后用酸性氯化钾直接提 取,氧化测定; (4)一般每克人造沸石能吸附30ugVB1,硫胺素量过大,回收 率下降; (5)铁氰化钾的用量要适当,过多会破坏硫胺素,过少则硫胺 素氧化不完全; (6)样液和标准液通过交换管的流速要一致,流速过快会因交 换不彻底或吸附不完全而影响测定结果。

维生素B2的测定 维生素B2即核黄素。在食品中以游离形式或磷酸酯等结合形式存在。膳食中的主要来源是各种动物性食品,其中以肝、肾、心、蛋、奶含量最多,其次是植物性食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜。 分析方法: GB/T 5009.85—2003中第一法为荧光法, 第二法为微生物法。

维生素C的测定 概述: VC又名抗坏血酸,广泛分布于新鲜果蔬及绿色植物中,新鲜的水果、蔬菜,特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑桔等食品中含量尤丰富。VC在生物机体中起重要功能。 固体VC比较稳定,但其水溶液极易氧化,氧化速度随温度升高pH增加而加快.维生素C具有较强的还原性,对光敏感,氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸,仍然具有生理活性。进一步水解则生成2,3 -二酮古乐糖酸,失去生理作用。VC在食品工业中常作抗氧化剂。 VC测定方法主要有2,6-二氯靛酚滴定法、2,4-二硝基苯肼比色法、荧光法、极谱法、HPLC法等。

(1)2,6-二氯靛酚滴定法测定维生素C 原理: 中性和弱酸性条件下,Vc能将2,6-二氯酚靛酚还原成无色的还原型2,6-二氯酚靛酚,同时Vc被氧化成脱氢Vc,因此可用2,6-二氯酚靛酚测样品中的Vc含量。Vc全部被氧化后,稍多加一点染料,使溶液呈淡粉红色,即为终点。如无其它干扰,则消耗的染料与样品中Vc含量成正比。

操作: Vc的提取:4g样品(加5ml2%草酸,研磨成匀浆)→转入50ml容量瓶(残渣用2%草酸提取2—3次)→并入50ml容量瓶(加2%草酸35ml)→用1%草酸定容到刻度→过滤或离心→滤液(清液)备用。 空白滴定:取20ml空白液(加35 ml2%草酸,用1%草酸定容到50 ml)用2,6-二氯酚靛酚滴定。 标准液滴定,取标准Vc液20ml2—3份,置三角瓶中,用2 .6-二氯酚靛酚滴定。 样液滴定,取样液20ml各2份,置于三角瓶中,进行滴定。

(2)2,4-二硝基苯肼法测定维生素C 原理: 总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸。样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸,再与2,4-二硝基苯肼作用生成红色脎,脎的含量与总抗坏血酸含量成正比,进行比色测定。 本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。 主要操作: (1)样品处理: (2)氧化处理: (3)呈色反应: (4)比色测定:

说明: (1)大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶,因此,抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用2%草酸溶液制成匀浆以保存维生素C。 (2)若溶液中含有糖,硫酸加得太快,溶解热会使溶液变黑。 (3)试管自冰水中取出后,颜色会继续变深,所以,加入硫酸后30分钟应准时比色。 (4)氧化用活性炭应用酸处理过无Fe3+;检查有无Fe3+方法? (5)硫脲的作用是防止VC的继续氧化,并促进脎的形成; (6)测定波长一般在495~540nm,当有较多杂质时选540nm较为合适。

重点 1、维生素的分类及其性质 2、各种维生素的测定方法 3、维生素的功能

生物与化学工程学院 刘 铁 兵 tbliu@126.com 食品分析 谢谢! 浙江科技学院 生物与化学工程学院 刘 铁 兵 tbliu@126.com