动物性食品微生物检验 动物性食品中结核分枝杆菌检验 主讲人：王福红

知识目标： 能力目标： 了解结核分枝杆菌的生物学特性 掌握结核分枝杆菌的检验方法掌握结核分枝杆菌的卫生评价与处理 能对样品进行采集与处理 能通过试验方法鉴定结核分枝杆菌

结核分枝杆菌 结核分枝杆菌是结核病的病原体。结核病是人畜和禽类共患的一种慢性传染病。 结核分枝杆菌主要有三个型：牛型、人型和禽型结核杆菌。 人还可因饮用未消毒牛奶或食用烹调杀菌不彻底的畜禽肉及禽蛋引起发病。

一、生物学特性 形态与染色特性：结核菌是直或微弯的细长分枝状杆菌。无芽胞、荚膜及鞭毛的革兰氏阳性菌，用一般染色方法较难着色，常用的方法为Ziehl-Neelsen氏抗酸染色法。

附：抗酸染色法（萋-尼二氏法） 染色液 （1）石炭酸复红染色液 碱性复红 0.3g 95%乙醇 10mL 5%石炭酸水溶液 90mL 将复红溶于乙醇中，然后与石炭酸溶液混合后，用滤纸过滤，备用。 （2）3%盐酸-乙醇 浓盐酸 3mL 95%乙醇 97mL （3）复染液 碱性美蓝染色液。

染色步骤 （1）将涂片在火焰上加热固定，滴加石炭酸复红染色液，徐徐加热至有蒸气出现，但切不可使沸腾。染液如因蒸发减少时，应随时添加。染5min，倾去染液，水洗。 （2）滴加盐酸-乙醇脱色，直至无红色脱落为止（所需时间视涂片厚薄而定，一般为1～3min），水洗， （3）滴加碱性美蓝染色液，复染30～60s，水洗，待干，镜检。 结果：耐酸性细菌呈红色，其他细菌、细胞等物质呈蓝色。

培养特性： 结核杆菌为严格需氧菌，对营养的要求比较严格. 生长过程还需要铁、磷、钾、镁等离子。 生长最适pH值：牛型菌为5.9-6.9，人型菌为7.4-8.0，禽型菌为7.2。 生长最适温度为37.5℃。

在固体培养基上，菌落生长缓慢，特别是初代培养，以禽型生长最快，人型次之，牛型最慢。菌落干燥、表面粗糙、质硬，初为乳白色，以后略显黄色或乳酪色，培养较久菌落互相融合成菜花状。

在液体培养基上，37℃3～4周后在液体表面形成多邹的菌膜，有附着于瓶壁的倾向，培养较久，表面菌膜颗粒脱落沉于管底。

生化反应：各型的结核分枝杆菌均不发酵糖类，人型结核的触酶（过氧化物酶）比牛型强。有毒力的结核杆菌和一些典型分枝杆菌能与中性红染料结合而呈中性红试验阳性。

血清学特性 ：结核杆菌的菌体含有蛋白质和核酸，细胞壁含有类脂、多糖及蛋白质复合物，结核杆菌细胞壁是激发机体迟发型变态反应的抗感染免疫的物质基础，也是一种良好的免疫佐剂。

类脂质：结核杆菌的类脂质主要有磷脂、脂肪酸和蜡质三种成分。磷脂产生干酪样坏死。脂肪酸中的结核菌酸，能促进机体形成结节的作用。蜡质是抗酸性染色的基础。蜡质中的多肽糖脂能引起动物Ⅳ型变态反应。 蛋白质：结核杆菌具有多种蛋白成份，其中有的能使机体致敏，产生结核菌素反应。 多糖：多糖主要与类脂质结合，存在于菌体细胞壁中，系半抗原，耐热，与特异免疫血清可产生沉淀反应。

抵抗力：结核杆菌在外界环境中生存力较强。 含有丰富的脂类故对乙醇敏感，在70%乙醇中2min死亡。此外，脂质可防止菌体水分丢失，故对干燥和湿冷的抵抗力很强，在干燥的痰中能存活10个月。 对湿热抵抗力差，60℃30分钟即死亡。 结核分枝杆菌对紫外线敏感。直接日光照射数小时可被杀死，可用于结核患者衣服、书籍等的消毒。

在水中可存活5个月，在土壤中7个月。 对常用消毒药抵抗力较强，如5%来苏儿48h死亡、3%-5%甲醛溶液12h死亡等，在70%酒精或10%漂白粉中需经4天死亡。 结核分枝杆菌对酸（3% HCl或6% H2SO4) 或碱（4% NaOH) 有抵抗力，15min不受影响。 对链霉素、异烟肼、对氨基水杨酸、环丝氨酸和利福平等药物敏感。

顽固性 因结核杆菌体内含有大量类脂质，占结核菌干重的40%，细胞壁内含量最多，因其富脂外壁的疏水性之故，一般的消毒剂难以渗入，对外界条件有异常大的抵抗力，使通常的灭菌方法易失败，15%硫酸或15%氢氧化钠溶液处理30分钟，可杀死一般的病原菌，但不能杀死结核杆菌。在阴暗潮湿的地方可生存数月，在阳光暴晒下能生存数小时，在-7℃以下可生存4~5年。但在沸水中（100℃）数分钟可死亡，因此，煮沸消毒是最有效最经济的方法。醇脂性溶剂—酒精能渗入其酯层而发挥奇效，用75%酒精2分钟便可将它杀死。

条件性 结核菌在含氧40%～50%并有5%～10%CO2和温度为36℃±5℃，合适PH值为6. 8～7

懒惰性 结核杆菌生长缓慢，无运动能力，性情懒惰，其最快分裂增殖速度为18小时一代，而大多数细菌都是几分钟或几十分钟便繁殖一代，如大肠杆菌约需20分钟便可繁殖一代，10小时后，一个大肠杆菌繁殖10亿个以上，可是一个结核杆菌18个小时才繁殖2个。可别小看或轻视结核杆菌带有这种欺骗性形似疲惫的懒惰行为，大量科学家在实验室或医务人员在临床与它进行长期斗争的实践一再证明，我们与它斗争的手段还没有提高到一个高水平上来。

变异性　结核分枝杆菌可发生形态、菌落、毒力、免疫原性和耐药性等变异。卡介苗（BCG）就是Calmette和Guerin 2人(1908)将牛结核分枝杆菌在含甘油、胆汁、马铃薯的培养基中经13年230次传代而获得的减毒活疫苗株，现广泛用于预防接种。

机体抵抗力强时——增生性炎：由类上皮细胞和巨噬细胞集聚结在结核菌周围，构成特异性肉芽肿。

当机体抵抗力降低时——渗出性炎：即在组织中有纤维蛋白和淋巴细胞的弥漫性沉积，之后发生干酪样坏死、化脓或钙化。 肺脏干酪样结核结节

结核病灶最常见于肺、肺门淋巴结、纵膈淋巴结，其次为肠系膜淋巴结和头颈部淋巴结，也见于胃肠道黏膜、乳房、胸腹腔浆膜等处。

胸膜和腹膜可发生密集的结核结节，一般为粟粒大至豌豆大的半透明或不透明的灰白色坚硬结节，形似珍珠，即所谓的“珍珠病”。

二、检验 样品的采取：猪常采取颌下淋巴结，禽类常采取肝脾，牛（奶牛、水牛）生前以专用的硬质橡皮管取痰液、乳汁、精液和粪便为材料，死后取患病部位的病理材料检验，乳及乳制品和肉食品采样同食品微生物检验样品的采集与处理 。

样品的处理 取适量食品，置灭菌乳钵中与无菌海砂一起研磨，使成为乳浆状。按1：5比例加入消化液(NaOH和溴麝香草酚兰)，进行消化和杀死杂菌。置37℃温箱中或37℃水浴中1～4小时，在此期间经常取出振摇。加温后取出，滴入适量的25%盐酸溶液，使溶液成pH6.8～7.0，即消化液由蓝色变为草绿色。将其于3000转/分钟离心沉淀30分钟，倾去上清液，加入3～4mL无菌生理盐水，使成混悬液，即为检样。 若样品为痰液，将痰液倾入离心管中，加入2～3倍量的4%氯化钠，置37℃温箱中30分钟，在此期间振摇1～2次，取出后加0.02%酚酞指示剂数滴，以2.5%的盐酸滴定至无色为止，再以3000转/分钟离心沉淀30分钟，取沉淀物为检样。

乳汁取5mL于离心管中，加乙醚或二甲苯1mL，振摇20分钟，再加无菌生理盐水至管口，室温静置30～60分钟。若加乙醚时结核杆菌浓集于中层，而加二甲苯时菌浓集于上层，以洁净的毛细吸管吸取中层或上层液，以3000转/分钟离心沉淀30分钟，弃去上清液，取沉淀物为检样。 粪便取约小指头大小，装于平皿中，加0.1%黄色素液5～7mL，充分搅拌后纱布过滤，再加2倍量的1%硫酸液搅拌后静置1小时，离心沉淀，取沉淀物检查。 尿液取5mL，加0.5mL醋酸，离心后弃去上清液，沉淀物中加2倍量的无水酒精，再以3000转/分钟离心沉淀，分成三层，取上层液检验。 患病器官结核病材料，可直接做涂片染色镜检或培养。

检验方法 镜片检验 分离培养 鉴别试验 动物试验 变态反应检查 结果 报告

1．涂片镜检 制备涂片：用以上处理好的材料制成涂片、晾干、火焰固定后，用凄-尼氏染色，结核杆菌染成鲜红色而其它细菌，细胞染成蓝色，如被检视野中细菌数较少，可采用厚涂片法，以提高检出率。

2．分离培养 试验方法：将处理物接种于罗氏罗氏或小川氏斜面培养基上，试管塞改用胶塞并用蜡密封防止干燥 。 培养：37℃，24～48h，使接种物与培养基充分接触，然后直立继续培养。 观察结果：经常观察生长情况，如阳性标本则在3周后可见有细小的菌落生长，阴性者观察到8周报告。如见到淡黄色、干燥、粗糙不平的菌落，进行抗酸染色后镜检，疑为结核杆菌时做以下试验。

结核分枝杆菌在罗氏菌落特征 典型菌落：菌落呈颗粒、结节或花菜状，乳白色或米黄色，不透明。

3.鉴别试验 1 中性红试验 2 烟酸试验 3 接触酶试验

（1）中性红试验 试验原理：人型结核分枝杆菌可以合成烟酸，使pH值下降，中性红指示剂的变色范围：pH为6.8～8.0，酸色为红色，碱色为黄色。 试验方法： 取可疑菌落数个，放在盛有5mL5%甲醇溶液的小试管中，37℃水浴加热1小时，弃上清液，加5mL50%甲醇，37℃加温1小时弃上清液，再加新配制的碱性缓冲液（5%氯化钠，1%巴比妥钠）5mL及中性红溶液0.2mL，37℃水浴作用1小时，每15分钟振摇1次。 观察结果。

中性红试验结果 如在黄色缓冲液中出现粉红色菌落者为阳性反应。 非致病性结核杆菌呈黄白色或不变色。

(2)烟酸试验 试验原理：人型结核分枝杆菌可以合成烟酸，其他型结核分枝杆菌不可以合成烟酸。 试验方法： 取3～4周龄培养物，在其内加无菌盐水1mL，浸没全菌静置15分钟。取出浸出液0.5mL于另一试管中，加入新配制的苯胺酒精溶液（4mL苯胺溶于96mL95%酒精中）及10%溴化氰水溶液，混合。 观察结果：结果液体为黄色者为人型结核菌菌株，不变者为其它型。

（3）接触酶（过氧化氢酶）试验 试验原理：某些细菌能产生触酶，触酶能使过氧化氢快速分解成水和氧气。 试验方法： 自鉴别平板上直接挑取数个可疑菌落于一无菌管中，加2mL新配制的3%过氧化氢溶液，立刻观察。 观察结果。

触酶试验结果 液面出现气泡者为阳性反应，为致病菌株。 无气泡者为非典型分枝杆菌。

4．动物试验 试验方法： 选择300～400g的豚鼠，腹腔皮内注射0.1mL结核菌素，无炎肿者方能使用。

4．动物试验 观察结果： 检样接种后3～4周，如材料中含有足够的结核菌，可见接种部附近淋巴结肿大，采食减少，消瘦，不久即死亡。 如菌量少时无明显症状，自第6周起每2周做1次结核菌素试验，若为阳性，两周后解剖观察。结果是接种局部淋巴结肿大，淋巴结内充满干酪样物质，肝脾常有许多微小的结核病变，严重者其他部位也有病变，取病变部或病灶内干酪样物，涂片染色镜检加以证实。

5．变态反应检查 家畜检查： 检查方法：在颈部上1/3处剪毛消毒，皮内注射提纯结核菌素0.1mL，注后72小时观察结果。 结果判定： 阳性反应为皮厚差在4.0mm以上 疑似反应在2.1～3.9mm，对疑似反应者应在原注射部位以同样剂量做第二次注射，并于第48小时记录结果，如仍为疑似，应于检查后30～45天后复检，结果仍为疑似的，可酌情处理。 阴性反应在2.0mm以下。

家禽检查： 检查方法：禽类在肉髯部用2500单位/mL的稀释液0.1mL 皮内注射，24小时观察结果。 结果判定： 如肉髯下垂，肿大、发热时判为阳性 否则为阴性。

结核病

6．报告结果 根据结果报告。

三、卫生评价与处理 加强检疫，防止疾病传入；净化污染群；培育健康畜群。 引进动物要隔离检疫。 奶牛场每年春秋两季进行结核病检疫，用结核菌素作变态反应，结合临诊检查。 发现阳性病畜及时销毁处理。 宰后检疫发现全身性结核或局部结核的，其胴体及内脏一律销毁处理。

三、卫生评价与处理 肉品检验时发现全身性结核或局部结核的，其胴体及内脏参照GB16548-2006《病害动物和病害动物产品生物安全处理规程》中的规定进行合理处理。

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