第3章 紫外－可见分光光度法（ultraviolet and visible spectrophotometry; UV-vis ） 概念：研究物质在紫外-可见光区分子吸收光谱的分析方法。（近紫外光区 200-400nm，可见光区400-760nm） A λ

波长nm 频率Hz 波数cm-1 波段 波谱 跃迁方式 10-3~-2 ~1 ~ 102.7 ~104 106.2 108 109 1020-19 1017 1014.3 1012.8 1010.7 ~109 ~108 波数cm-1 1010-9 ~107 104.3 102.8 8 0.1 0.01 波段 γ-射线 X-射线 紫外 可见 红外 微波 射频 波谱 γ-射线光谱 X-射线波谱 紫外光谱 可见光谱 红外光谱 顺磁共振 核磁共振 跃迁方式 核反应 内层电子跃迁 外层电子 跃迁 分子振动 分子转动，核自旋

分光：将复合光变成单色光叫分光 红外 可见光（400-760nm） 红橙黄绿青蓝紫 610-780 分光系统 400-435 紫外

特点：灵敏度高（10-6g/ml），简单方便。 应用：1、定性分析 2、定量分析 发展趋势：与计算机联用及某些数学联用（如导数光谱）

§1 基本概念 电子跃迁： （1）跃迁类型 σ-σ*、п-п*、n-п*、n-σ* σ* 反键 п* 反键 能量 n 未成键 п 成键 σ §1　基本概念 电子跃迁： （1）跃迁类型 σ-σ*、п-п*、n-п*、n-σ* σ* 反键 п* 反键 n-σ* 能量 n-п* σ-σ* п-п* n 未成键 п 成键 σ 成键

（2）吸收强度（ε） ：I0与I相差越大， 吸收越强。 λ I △E I0 同型轨道跃迁几率大，吸收强；不同型轨道跃迁几率小，吸收弱。 如п-п*吸收强， n-п*吸收弱。 当ε>104，为强吸收； ε<103为弱吸收； ε=103-104为中吸收

λ I △E I0 注意：吸收何种光（ λ ）与能级差有关（△E） 吸收强度如何（ε）与跃迁机率有关。

(1) σ-σ* 跃迁：能级大，△E大，λmax小， σ-σ*的 λmax <150nm，远紫外吸收。 a 单个п键， λmax =200nm，末端吸收 b 共轭п键， λmax =210-250nm，ε>104。 A 末端吸收 λ 200nm

（3） n-п*跃迁，存在于-C=O，-C≡N， △E更小， λmax >250nm， ε=10-100。 (4) n-σ*跃迁，存在于-OH、-NH2、—X等。 λmax =200nm，末端吸收。

(二) 术语 A λ A表示物质对不同光的吸收程度 吸收曲线(吸收光谱): 以波长λ（nm）为横坐标，以吸光度A为纵坐标所描绘的曲线。 300 400 500 600 λ A表示物质对不同光的吸收程度

A λmax λ 吸收峰：曲线上吸收最大的地方，它所对应的波长称最大吸收波长（λmax）。 谷：峰与峰之间的部位叫谷，该处的波长称最小吸收波长（ λmin）。 末端吸收：在图谱短波端只呈现强吸收而不成峰形的部分称末端吸收。 吸收峰 肩峰（sh） A 吸收谷 末端吸收 λmax λmin λ

生（发）色团：可引起电子跃迁的不饱和基团。主要为п-п*、n-п*跃迁，如C＝C、C＝O等。 助色团：与发色团相连的饱和的杂原子或原子团。如－OH、－NH2、－OR、－SH、－SR、卤素原子等。

红移（长移）：使吸收峰向长波方向移动。如助色团、共轭键的影响。 蓝（紫）移（短移）：使吸收峰（λ）向短波方向移动。如共轭键减少或溶剂的影响。 增色效应和减色效应：使吸收强度（ε）增加称增色效应。反之称减色效应或淡色效应。 强带和弱带：化合物的紫外可见吸收光谱中，凡摩尔吸光系数值（εmax）大于104的吸收峰称为强带，凡εmax小于103的吸收峰称为弱带。

吸收带:说明吸收峰在紫外－可见光谱中的位置。可分为六种类型。 （三）吸收带及其与分子结构的关系 吸收带:说明吸收峰在紫外－可见光谱中的位置。可分为六种类型。 R带：由n-п*跃迁引起的吸收带。如C＝O –NO等 特点 ：（1）λmax>250nm （2） ε<100，为弱吸收 （3） 溶剂的极性越大， λmax减小 200nm 250nm

Π* Π* n 非极性溶剂 n 极性溶剂 例

K带：由共轭双键中п-п*跃迁所产生的吸收峰。 如 等。 特点 ：（1）λmax=210-250nm （2） ε>104，为强吸收 （3） 溶剂的极性越大， λmax越大 200nm 250nm

Π* Π* Π Π 非极性溶剂 极性溶剂 п-п*跃迁，K带

п-п*跃迁，K带 n-п*跃迁，R带 ， ， A K带 R带 λ 200nm 300nm

B带：苯环骨架振动和环内共轭п-п*重叠所致，是芳香族化合物的特征吸收带。 特点: (1)在非极性的溶剂中，B带230-270nm产生细微振动

（2）在极性的溶剂中，细微结构消失，中心吸收带λmax=256nm附近，ε在200左右。 （3）被取代时，细微结构消失 （4）B带是有机化合物的特征谱带 256nm 在水中 在环已烷中 蒸气 240nm 260nm

E带：由苯环结构中三个乙烯的п-п*所产生，分为E1和E2带。是苯环的特征吸收谱带。 E1带：λ＝180nm，ε＝4.7×104。 E2带：λ=200nm ε＝7000。

当苯环上有发色团取代并共轭时，E2带与K带合并，吸收带长移，且使B带长移。 例： B带 λmax 增大，282nm E2带与K带合并，移至210-250nm B R K

5 п п K带 4 K带 σ σ＊ logε n п* 3 n п* R带 n σ* R带 2 1 10 100 200 300 400 远紫外区 近紫外区 可见光区 5 п п П* П* K带 4 K带 σ σ＊ logε n п* 3 n п* R带 n σ* R带 2 1 10 100 200 300 400 500 600 700 800 波长(nm) 几种常见的紫外与可见吸收光谱

运用：预测一个化合物的吸收带可能出现的范围及吸收带的类型。 n п* R带（250-500nm） п 共轭 K带（210-250nm） П*

(四)影响吸收带的因素 1.位阻影响 立体空间结构影响共轭效应。 同分异构体： 反式二苯乙烯 顺式二苯乙烯

3.溶剂效应：除了影响吸收峰（λ）位置外，还影响吸收强度（ε）和光谱形状。 2.跨环效应 3.溶剂效应：除了影响吸收峰（λ）位置外，还影响吸收强度（ε）和光谱形状。 溶剂极性对异丙叉丙酮的两种跃迁吸收峰的影响 跃迁类型 正已烷 氯仿 甲醇 水 迁移 п-п* 230 238 237 243 长移 n-п* 329 315 309 305 短移

4.体系pH值的影响：主要是对弱酸弱碱性物质的影响。 非极性溶剂 非极性溶剂 极性溶剂 极性溶剂 п* n п* п 跃迁 跃迁 4.体系pH值的影响：主要是对弱酸弱碱性物质的影响。

§2 基本原理－吸光的定量关系 I0 I 一.参数 b I0、I、C、b、T、A量的关系 1.入射光的强度I0 2.透射光的强度I 3.透光率 T＝I/I0 百分透光率T％＝I/I0× 100％ I0、I、C、b、T、A量的关系 4.比色池厚度：b 5.样品浓度：C（mol/l，％） 6.吸光度：A＝－logT=lg(I0/I)

二.Lambert-Beer定律 Lambert定律：C一定，A＝-logT=K1b Beer定律：b一定，A＝-logT=K2c 两定律合并：A＝a·b·c a=K1K2 a为吸收系数 注：吸光度A是指某一波长（λ）下的吸光强度即入射光为单色光

吸收系数： 摩尔吸收系数(ε)：在一定条件下，当C＝1mol/l，b=1cm时的吸光度。 百分吸收系数（E 1cm 1% ）：一定条件下，当C＝1％，b=1cm时的吸光度。

特征：1）ε、E均为特征常数 2）ε、E是有条件的，同一物质，不同条件下所测值不同（波长不同、溶剂不同、温度不同等）。 3）ε、E越大，测定吸光度灵敏度越高。 4）ε=104-105为强吸收，103-104为中吸收，<103为弱吸收。 5） 用于定性判断，K带吸收大，ε、E 大，R带的ε、E小。

注：若溶液中存在多种吸光物质时，吸光度将是各组分吸光度的总和。 d 例：紫草素（C16H6O5 288.3），2.00mg溶于100.0mlEtOH中，b=1cm，λmax =516nm，A=0.484.求ε、E 注：若溶液中存在多种吸光物质时，吸光度将是各组分吸光度的总和。 d I0 I A总＝Aa+Ab+Ac+…… ＝ εadCa+ εbdCb+ εcdCc+…… a、b、c 注：每种物质的吸收度仅由本身的性质和C决定，与其它物质无关。

吸光度A具有加和性，对同一物质来说 浓度（C） 吸光度（A） 1C A 2C 2A 3C 3A 4C 4A 工作曲线 正偏离 A 负偏离 C1 C 线性范围：线性范围越大越好。

三、偏离Beer定律的因素 A＝a·b·c 影响吸收系数a的因素有： 1、物质的性质 2、波长的不同 3、其它因素 如溶剂的影响等 1)化学因素：离解、缔合、配位等化学变化，使吸光物质形态发生变化。溶剂、pH、温度等影响。

a 660nm ε ×104 A b 负偏离 c C 亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱 (a)6.36×10-6mol/l (b)6.36×10-4mol/l (c)6.36×10-3mol/l

2、光学因素 （1）单色光的纯度 Beer定律前题：入射光是单色光。 A A λ λ Λ2 λ1

I0 I I0 透光强度 I 可见光 760nm I/2 510-520 λ 400nm 复合光 单色光 狭缝 单色器 比色池 1 2 400nm 单色光的谱带宽s=λ2-λ1 谱带宽度: 狭缝具有一定宽度，使分离出的光同时包含了所需波长的光和附近波长的光。常用半峰宽来表示。

谱带宽度的值愈小，单色性愈好。但因仍是复合光，故仍可以使吸光度变小而偏离Beer定律。

（2）杂散光:与所需波长相隔较远的光。 Io I Is Is <

（3）散射、反射 克服方法： 比色池：擦干净 溶液：溶液均一，透明；用空白作参比。 （4）非平行光 克服方法：比色池位置放正确，与光路垂直。

3.透光率测量误差：△T （是偶然误差，来自噪声） 读数精度

不同T%或A时的浓度相对误差（ △T= ± 0.5%） 透光率T% 吸光度A △C/C×100% 0.022 ±10.2 80 0.097 2.8 70 0.155 2.0 0.022 1.63 0.399 1.36 0.523 1.38 20 0.699 1.55 10 1.000 2.17

△C/C A=0.434 T%=36.8% 0.2 0.7 A 结论：当A值在0.2-0.7，相对误差较小，是测量最适宜范围。

§3　显色反应及其显色条件的选择 　 一、有色物质的测定 二、显色后物质的测定

二、显色后物质的测定 1、显色剂与显色反应 显色反应：在光度分析中将被测组分转变为有色化合物的反应。 显色剂：与被测组分反应生成有色化合物的试剂，称为显色剂。

显色反应的选择原则 1、灵敏度高 从ε来判断 2、选择性好 3、稳定性好 显色反应生成有色化合物组 成稳定。 4、显色剂在测定波长处无明显吸收 一般要求两者最大吸收波长相差60nm 5、反应具化学计量关系

2、显色条件的选择 1）显色剂的选择：生成物稳定，且有一定的计量关系。 2）溶剂：根据反应物、生成物的溶解度确定。

3）显色剂的用量：应加入略过量的显色剂。 A A a b a b C C

4）酸度 溶液酸度的影响是多方面的。 （1）对显色剂颜色的影响 （2）对显色反应影响 5） 显色时间： A 注：确定实验方法要考察稳定性。 a b t 6） 显色温度：显色反应进行与温度有关。

3、反应条件的控制 确定反应条件，需通过实验考察，已确定 的实验条件，不应随意更改条件。

§4 测量条件的选择 1、测定波长的选择： 选择原则“吸收最大，干扰最小”。如出现几个最大吸收波长时，选择干扰最小，吸光度较大而且平坦的最大吸收波长。 2、控制吸光度测量范围 吸光度控制在0.2-0.7。 方法：调节溶液的浓度 改变吸收池的厚度

3、选择适宜的空白（参比）溶液 种类：（1）溶剂空白：溶剂作为空白。 适用：溶液中只有被测组分对光有吸收，其它组分对光无吸收。 （2）试剂空白：与样品相同条件下，不加试样溶液，其余均加。 适用：测定条件下，显色剂或其它试剂、溶剂对待测组分测定有干扰的情况。

（3）试样空白：如为显色反应，只是不加显色剂所制备的溶液。 适用：试样基体有色并在测定条件下有吸收。

药物中微量铁的测定 在2只25ml容量瓶中,用吸量管分别加入0.00,1.00ml铁标准溶液,分别加入1ml盐酸羟胺,2ml邻二氮菲,5ml醋酸-醋酸钠缓冲液,用水稀释至刻度后摇匀,主置10min.用1cm比色皿,以试剂为空白,在所选波长下,测量吸光度。

§5 紫外-可见分光光度计 复合光 I0 I 记录 单色光 检测器 I0 狭缝 单色器 比色池

一、组成：光源－单色器－吸收池－检测器－记录 钨灯、氘灯 狭缝、色散元件、 准直镜 比色池、比色皿 指针显示、数字显示 光电池、光电管、光电二极管阵列

光源 要求：发射强度足够且稳定 具有连续光谱 钨灯和钨卤灯：发射光能的波长覆盖宽，但紫外区很弱。常取波长大于350nm的光为可见区光源。寿命达10000小时。 氢灯和氘灯：发射波长为150-400nm的连续光谱。使用时间1000小时。

组成：进口狭缝、准直镜、色散元件、出口狭缝 单色器 将光源的连续光谱变成单色光。 组成：进口狭缝、准直镜、色散元件、出口狭缝 进口狭缝 准直镜 混合光 色散元件 出口狭缝 单色光

1）色散元件：棱镜和光栅 棱镜:对不同波长的光有不同的折射率。 缺点：色散后光谱按波长排列疏密不均，长波区密，短波区疏。为非均匀分布光谱。 红 紫 分光系统

光栅:利用光的干涉作用。 光 特点：色散后的光谱，各谱线间距离相等，是均匀分布的连续光谱。

2）准直镜：以狭缝为焦点的聚光镜。将发散光变为平行光，将色散后的平行光聚焦。

3）狭缝：狭缝宽度直接影响分光质量。过宽，单色光不纯，太窄，光通量小，降低灵敏度。

吸收池（比色池、比色皿） 1）型号有：0.5、1.0、2.0、5.0cm 2）用玻璃制成的吸收池，只能用于可见光区。 3）用石英制成的吸收池，可用于紫外光区。

使用前进行检查： 透光率检查：以空气为参比 空气T%=100%，比色皿应T%>84% 4）吸收池两光面易损蚀，应注意保护， 装溶液时，要擦净。若被污染，要洗净。

配对性检查： 溶液于440nm处测定透光率。 5）使用时：应选择透光率误差小于0.5%比色皿配对使用。 6）应注意比色池在光路中的位置要正确。

检测器 将光能转变成电能的装置。 要求：灵敏度高，噪声低 光电池：是一种光敏半导体。 A 分类：硒光电池和硅光电池。 检测器 将光能转变成电能的装置。 要求：灵敏度高，噪声低 光电池：是一种光敏半导体。 A 分类：硒光电池和硅光电池。 特点：光电流大小与照射光强成正比。 光电流不易放大，光强弱时，不能测量。 易“疲劳”，不能长时间使用。

光 光电管 光敏阴极 阳极 放大器 指示器 特点：电流可放大，较有高灵敏度。 有“疲劳现象”

光电倍增管 光 倍增极（共9个） 档板 阳极 光电倍增管大大提高了仪器测量的灵敏度。

光二极管阵列检测器：由一系列的二极管紧密排列在一块硅晶体片上组成。 例：HP8452A型二极管阵列：波长范围为190-820nm，二极管316个。 A 特点：测量速度快 λ

信号显示系统（记录系统） 分类：指针显示 数字显示 50% 50% 100% 100% T% T% A A 721型分光光度计显示系统 721型分光光度计显示系统

三、几种光路的仪器 1、单光束（传统） 特点：仪器结构简单，灵敏度高，但对光源发光强度稳定性要求高。

2、双光束：普遍被采用。 特点：可减免因光源强度不稳而引入的误差，但灵敏度较单光束差。

3、二极管阵列 特点：全波长测定，测定速度快。

§5 分析方法 一、定性方法 光谱特征：光谱形状、吸收峰数目、吸收 峰波长位置（峰形、峰数、峰位） 定性依据：1、结构相同的化合物在相同条件 下有完全相同的吸收光谱。 2、吸收光谱不同，一定不是相同物质。 3、吸收光谱相同，可能是相同物质。

定性鉴别方法： 1.比较吸收光谱 将试样与标准样品谱图或文献所载的标准图谱进行核对。

局限性：不同种化合物可以有雷同的吸收光谱，因此得到相同的吸收光谱，应考虑并非同一物质的可能。 醋酸泼尼松 醋酸可的松 醋酸氢化可的松 局限性：不同种化合物可以有雷同的吸收光谱，因此得到相同的吸收光谱，应考虑并非同一物质的可能。

1、比较吸收光谱特征数据λmax 、εmax一致性 对比法 1、比较吸收光谱特征数据λmax 、εmax一致性 决诺酮 安宫黄体酮

2、比较吸光度（吸光系数）的比值 不只一个吸收峰的化合物，可用在不同吸收峰处测得吸光度比值作为鉴别的依据。可消除绝对误差(或浓度、吸收池厚度)。 例：中国药典规定：B12在361nm、278nm吸光度的比值应为1.70-1.88;361nm、550nm比值为3.15-3.45。

二、结构分析 作用：推断发色团及其之间的共轭关系，推断分子的骨架。 １、饱和碳氢化合物 这类化合物在200-400nm没有吸收，在紫外吸收光谱分析中常用作溶剂。

2、在200nm左右有吸收，可能有孤立双键。 3、含有K带吸收，有共轭双键。 4、含有R带吸收，有C＝O等键 5、含有B带，有苯环

三、纯度检测： 1、杂质检查 A 化合物 无吸收 杂质 强吸收 则含少量杂质可用光谱检查出来

B 化合物 强吸收 杂质 无吸收 杂质存在使化合物的表观吸收系数值降低 C 化合物 强吸收 杂质 更强吸收 杂质存在使化合物的表观吸收系数值升高

2、杂质限量检测： 肾上腺素中含杂质肾上腺酮 在310nm处，A<0.05 肾上腺酮 肾上腺素 310nm

§5 定量分析方法 测定条件： ①波长的选择 ②控制A大小 ③选择合适的溶剂

选择合适的溶剂 选择原则：a 安全、无毒 b 被测物的溶解度大 C 不干扰：许多溶剂本身在紫外光区有吸收峰，所选用的溶剂应不干扰被测组分的测定。 截止波长：10mm光径长度透过率<25%（A=0.6020）的波长。 组分的测定波长必须大于溶剂的截止波长。

一些常用溶剂性质 溶剂 极性 截止波长（nm） 危险性 蒸馏水 78.5 <200 无 正已烷 1.9 199 易燃 无水乙醇 24.3 215 甲醇 32.6 易燃/有毒 环已烷 2.0 211 氯仿 4.8 245 二甲亚砜 270 有毒 丙酮 20.7 331

注：使用易挥发性溶剂，最好用带盖的样品池，以防溶剂挥发，改变样品浓度。 综上所述：常用溶剂中水、异丙醇、甲醇、乙醇 首选水，其次是甲（乙）醇。 甲醇用途广范：原因主要是粘度小，色散小。 异丙醇有溶解气泡的能力，折射光少，但价格较高。

一、单组分样品的定量方法 （一）吸光系数法 根据公式 或 计算物质浓度的方法，也称绝对法。 例1：VB12的水溶液在361nm处的 b=1cm，测得A=0.414，则溶液浓度为？

例：B12样品25.0mg用水溶成1000ml后，盛于1cm吸收池中，在361nm处测得吸光度A为0.507，则：求其纯度？

（二）、工作曲线法（标准曲线法） 步骤：①标准曲线的绘制 配制系列标准溶液，测定吸光度，绘制曲线。 ②测定样品吸光度。 ③计算样品浓度。

标准曲线的绘制 1、配制系列标准溶液，测定吸光度，绘制曲线。 A A A C C C

2、影响标准曲线不通过原点的原因： （1）空白溶液的选择和配制不当，不能完全消除干扰。 （2）显色反应不够灵敏，被测组分低于某一浓度时不能显色，无吸光度。 （3）吸收池的厚度或光学性能不一致；吸收池位置安放不妥；吸收池透光面不洁净等。

计算样品的浓度 方法：1、作图法 2、建立回归方程

相关系数（r）：显示所测数据的线性关系。0<r<1，r越接近1，线性越好。紫外分光光度法一般要求r>0.999以上为好。 造成r不合要求的原因:a 操作者操作误差太大.减免方法:重新操作. b 所选浓度范围不对,太大或太小,重新浓度范围.

标准曲线法应注意的问题 （1）制备一条标准曲线至少要5个点 （2）待测样品浓度应包括在标准曲线浓度范围内 （3）待测样品和对照品必须使用相同的溶剂系统和显色系统，并在相同条件下测定。 （4）仪器更换元件，维修或重新校正波长时，必须重新制作标准曲线。

（三）对照法 单点法对照法 在同样条件下配制标准溶液和样品溶液，在选定波长处，分别测量吸光度。 使用条件：a通过原点时可用。