原发性开角型青光眼MYOC基因 C1009缺失突变致病机理的研究 谢小兵 湖南中医药大学第一附属医院 湖南 郴州 2012年8月

内容纲要 一、青光眼概述 二、原发性开角型青光眼突变 基因筛查 三、青光眼致病机理研究 --基因功能研究（细胞/动物水平）

一、青光眼概述 原发性 继发性 开角型 闭角型 病因学 前房角 发病年龄 婴幼儿型 青少年型 成人型 ① ② ③ 发病情况：是世界上第二大致盲性眼病，仅次于白内障。其分类有多种，其中近一半为原发性开角型青光眼（primary open angle glaucoma，POAG）。2010年全世界有6000多万人患有POAG，其中有450万人会失明。 原发性 继发性 开角型 闭角型 病因学 前房角 发病年龄 婴幼儿型 青少年型 成人型 ① ② ③ 疾病基本特征：病理性高眼压、视神经萎缩、视盘凹陷扩大及进行性视野缺损（视力减退）。 病因：尚不清楚，一般认为是由多种因素引起。现认为主要是由遗传和环境因素相互作用所致。

前房形态 前房的位置 房水循环示意图 开角型青光眼示意图 闭角型青光眼示意图

正常房水循环途径 睫状肌 后房 瞳孔 前房 施莱姆氏管 前房角 小梁网 （Schlemm） 集液管 房水静脉

青光眼的相关致病基因：目前至少发现7条染色体与POAG相关。MYOC基因是最先确定的与POAG相关的致病基因。 青光眼的遗传倾向：大量的家系调查发现，约13%～47%的开角型青光眼具有家族史，开角型青光眼发病率为2.8%～16.4%，远高于正常群体的发病率。 青光眼的相关致病基因：目前至少发现7条染色体与POAG相关。MYOC基因是最先确定的与POAG相关的致病基因。 1q24～25 1号染色体： MYOC基因： 图1 1号染色体结构及MYOC基因结构图

已报道的与POAG有关的致病性MYOC基因突变

二、突变基因的筛查

（一）大型原发性开角型青光眼家系调查： 1.该家系共56人，其中男性27人，发病7人，女性29人，发病4人。 2.MYOC基因突变筛查 ：RFLP、SSCP法筛查 3.突变蛋白二级结构分析及统计学分析

Tyr437His（human)、Tyr423His(mouse) 、 Pro370Leu、 Glu337Arg、Gly357Val等。 研究发现在不同地区不同种族POAG的MYOC基因突变现象并不相同，MYOC 90%的基因突变位于第3个外显子。目前较肯定的与青光眼发病有关的突变有: Tyr437His（human)、Tyr423His(mouse) 、 Pro370Leu、 Glu337Arg、Gly357Val等。 1. Transgenic Mice Expressing the Tyr437His Mutant of Human Myocilin Protein Develop Glaucoma Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008 May ; 49(5): 1932–1939. 2. Expression of Mutated Mouse Myocilin Induces Open-Angle Glaucoma in Transgenic Mice The Journal of Neuroscience. November 15, 2006, 26(46):11903–11914

实验分组： 1. 青光眼家系组(56人） 2. 正常对照组（200例） 入选标准： ⑴ 体检健康者； ⑵ 年龄20~60岁； 入选标准： 　 ⑴ 体检健康者；　 ⑵ 年龄20~60岁； ⑶ 无青光眼家族史； ⑷ 眼底及眼压检查正常者。

突变筛查： ①DNA的提取：外周血用改良NaI法提取模板DNA ②PCR扩增： 引物设计： ③ 产物鉴定： MYOC第一外显子：6对引物；PCR产物分别命名为MYOC 1～6 ； MYOC第二外显子：1对引物；PCR产物命名为MYOC 7 ； MYOC第三外显子：6对引物；PCR产物分别命名为MYOC 8～13 。 ③ 产物鉴定： 2％琼脂糖凝胶电泳检测产物条带

④PCR产物酶切及突变分析： PCR-RFLP法共筛查了分布于MYOC基因三个外显子的13个点突变，酶切产物经8％PAGE鉴定。

所筛查的突变位点及酶切结果 C1009del 氨基酸 改变 碱基 PCR区段 限制性 内切酶 酶切片段（bp） 结果 ln337stop Pro13Leu C38T MYOC 1 Asu I 未突变 突变 155,19 174 5例可疑 Arg46Term C136T MYOC 2 BsuRⅠ 118,78 196 无异常 Gln48His G144T BseNⅠ (BsrⅠ) 69,127 Arg76Lys G227A MYOC 3 Alw261 (BsmAⅠ) 93,96 189 3例可疑 Asp208Glu C624G MYOC 7 57,177 57,77,100 Gly246Arg G736A MYOC 8 BseLⅠ (BsiYⅠ) 48,129 177 ln337stop C1009del MYOC 10 Bme1390Ⅰ 56,61,73 56,134 12例可疑 Ile345Met A1036G PagⅠ (BspHⅠ) 190 84,106 Pro361Ser C1081T 6,129 Gly367Arg G1099A BseDⅠ (SecⅠ) 8,15,42,53，72 8,53,57,72 Asp380Asn G1138A MYOC 11 Tru1Ⅰ 197 49,148 Ile477Ser T1430G MYOC 13 NmuCⅠ (Tsp45Ⅰ) 73,106 53,53,73 Pro481Leu C1442T MnlⅠ 25,154 25,74,80

1：家系病人（（C,T）杂合子） 2：正常对照组 3： PCR产物 M：DNA marker 具体酶切结果如下： 1. MYOC 1片段全长174bp，检测出了一个位于第一外显子的新的点突变38C→T。未突变片段存在限制性内切酶Asu I的酶切位点，突变后则该酶切位点消失。经该酶消化完全后，可见明显的杂合子条带。该突变存在于家系的4例已确诊病人和1例可疑者中，在对照组中未检出。 MYOC 1片段Asu I酶切结果图 1：家系病人（（C,T）杂合子） 2：正常对照组 3： PCR产物　 　 M：DNA marker

2. MYOC 3片段全长189bp，未发生突变时有一个Alw261酶切位点，酶切后片段为93bp和96bp，若发生突变则酶切位点消失。经酶切，发现酶切后片段为93bp、96bp和189bp者3例，为杂合子，由于93bp和96bp两条片段只相差3bp，在8%的PAGE上分辨率比较低，只能观察到重叠影。证实发生了G227T突变。 　MYOC 3片段Alw261酶切结果图 1：杂合子 2：纯合子 3：PCR产物　 M：DNA Marker

3. MYOC 10片段全长190bp，未发生突变时有2个Bme1390Ⅰ酶切位点，酶切后片段为56bp、61bp和73bp，若发生1009位点突变，则酶切后片段为56bp和134bp。经酶切，发现酶切后片段为56bp和134bp者2例，片段为56bp、61bp、73bp和134bp者10例，存在1009位点C碱基缺失突变。 MYOC 10片段酶切结果图 1：杂合子　2：未突变产物 3：纯合子 4：PCR产物 M：DNA　Marker

⑤阳性PCR产物测序结果 将根据酶切筛选出的异常结果进行双向测序，测序表明在38位点C变为T，227位点G突变为A，在1009位点发生C碱基缺失。 C38T（Pro13Leu）测序图 （箭头所指为杂合子双峰）

PCR产物测序结果 G227A(Arg76Lys)测序图 C1009del(Gln377stop)测序图

⑥统计学分析 在该56人的家系中， 227G→A、C1009del 和38C→T三种突变筛选情况如下表： 家系中三种突变的筛选情况 突变 确诊(例） 表型正常（例） 合计 （例） 正常对照组 （例） 227G→A 2 1 3 C1009del 11 12 38C→T 4 5

结论 1. 本研究在POAG家系中，共发现MYOC基因三个突变,分别是G227A、C1009del和C38T,其中后两个突变为首次发现。 2. G227A突变者3例，其中2例为已确诊的POAG病人,1例为家系中表型正常人，对照组中未发现 3. C1009del突变者12 例，其中11例已经确诊POAG,在1例4岁的子代亲属中也发现该突变。正常对照组中未发现 4. C38T突变存在于4例已确诊的POAG病人和1例可疑者中，正常对照组中未检出。这三个突变的发病率在家系组和正常对照有统计学意义。

FJ237047 C1009del

（二）蛋白结构的生物信息学分析

进行蛋白质结构分析 （蛋白质分析软件Antheprot4.3） 蛋白质一级结构分析 ： 1.第227位点的碱基改变G→A导致第76位氨基酸由精氨酸变为赖氨酸（Arg76Lys）。 G227A（Arg76Lys）突变前后氨基酸序列对比

2. 第1009位点的C碱基缺失(C1009del)导致终止密码子提前出现

3. 对38位C碱基突变为T碱基，导致第13位氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸。

G227A（Arg76Lys）突变前后蛋白质二级结构预测（DMP法） 蛋白质二级结构预测分析 1. G227A（Arg76Lys）突变前后，蛋白质结构未发生明显变化 G227A（Arg76Lys）突变前后蛋白质二级结构预测（DMP法）

C1009del突变前后蛋白质二级结构预测（DMP法）

C38T突变前后蛋白质二级结构预测对比（DMP法） 导致蛋白质的氨基酸序列发生了改变（脯氨酸→亮氨酸），但并未造成蛋白质的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲等二级结构的明显改变。 C38T突变前后蛋白质二级结构预测对比（DMP法）

蛋白质理化特性分析 分析结果：突变前后蛋白质的抗原性、亲水性、疏水性、溶解性等理化性质都未发生明显改变 G227A（Arg76Lys）突变前后蛋白质理化特性曲线 分析结果：突变前后蛋白质的抗原性、亲水性、疏水性、溶解性等理化性质都未发生明显改变

分析结果：蛋白质的抗原性、亲水性、疏水性、溶解性等理化性质都发生了较大变化。 C1009del突变前后蛋白质理化特性曲线 分析结果：蛋白质的抗原性、亲水性、疏水性、溶解性等理化性质都发生了较大变化。

分析结果：蛋白质的抗原性、亲水性、疏水性、溶解性等理化性质未发生明显改变。 C38T突变前后蛋白质理化特性曲线对比 分析结果：蛋白质的抗原性、亲水性、疏水性、溶解性等理化性质未发生明显改变。

结论 1. 蛋白质的一级结构分析结果显示 G227A突变→ Arg76Lys； C1009del导致氨基酸发生移码突变； C38T突变→Pro13Leu 2. 蛋白质二级结构分析结果显示G227A突变前后和C38T突变前后，蛋白质的结构和性质未发生明显改变，而C1009del突变前后，蛋白的物理性质发生了明显变化，这些性质变化可能影响了蛋白之间的相互反应，可能与青光眼的发生相关。

MYOC基因突变致病机理？ 青光眼发生的分子机制？ 房水循环 青光眼

三、转基因细胞水平功能研究

（一）RNA干扰技术对MYOC基因 C1009del突变小梁细胞模型的构建

流程

1、目的基因RNA干扰慢病毒载体制备 针对目的基因靶序列，利用公用网站按照RNA干扰序列设计原则，设计多个RNA干扰靶点序列，选择最佳靶点；

阳性克隆质粒抽提： 琼脂糖凝胶电泳图： 1 号泳道：marker；10 kb，9 kb，8 kb，7 kb，6 kb，5 kb， 4 kb，3 kb，2 kb，1Kb，900 bp，750 bp， 600 bp，500 bp 2、3、4、5号泳道分别代表psc-1、psc-2、psc-3、psc-4质粒载体； 6 号泳道代表pscNC（普适性阴参对照）质粒载体。

2、目的基因过表达载体构建 PCR鉴定阳性克隆 1# ：阴性对照（ddH2O） 2# ：阴性 对照（空载组）3# ：阳性对照（有确定插入片段的载体组）4# ：Marker： 5 kb，3 kb，2 kb，1.5 kb，1 Kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp 。5#-10#为 pEGFP-N1-MYOC

阳性克隆测序 使用293T细胞检测融合基因是否表达 因真核表达载体pGFP－N1上含有绿色荧光蛋白GFP的基因，当重组融合基因成功转染进入293T细胞后，如果融合基因能够表达，则绿色荧光蛋白也被翻译，从而细胞在荧光显微镜下可显示绿色荧光，故可通过观察绿色荧光的有无来判断融合基因是否表达。 荧光镜检与白光镜下结果 ： 293T细胞荧光镜检结果 293T细胞白光镜检结果

3、Western Blot筛选RNAi有效靶点 构建好含有目的基因的过表达克隆质粒和针对靶基因不同干扰靶点的RNAi病毒载体质粒，共转染培养好的工具细胞（即293T细胞），转染24h荧光显微镜下观测转染效果，转染36～48h收集细胞抽提蛋白，采用Western blot检测目的蛋白的表达情况，进而判断不同靶点的干扰效果。

（2） Western Blot检测目的基因表达水平 （第一次实验的knockdown检测） Western Blot 结果扫描 （第二次实验的knockdown检测） 注释：PC：加入pcDNA3.1质粒； NC1：对照组1，不含干扰靶点的敲减质粒； NC2：对照组2，含有紊乱序列的敲减质粒； 1＃，2＃，3＃，4＃：含有不同干扰靶点的敲减质粒； 0.5µg，1.0µg：加入的质粒量

结 论 本实验通过设计并构建4个针对目的基因的4个干扰质粒，通过两次筛靶实验的结果可以看到，1#，2#和3#对MYOC有敲减作用，在两个质粒浓度下的作用基本是一致的。此外，4#也有一些作用，特别是在高浓度下，随机选择3#干扰靶点(PSC 413)进行慢病毒大量包装。

4、检测小梁细胞MYOC基因Knock Down效率 细胞总RNA抽提： RNA逆转录获得cDNA Real-time PCR检测

定量PCR扩增曲线第一次 定量PCR扩增曲线-第二次

统计学分析 结果统计图-第一次 结果统计图-第二次 注： CON:未感染任何病毒的小梁细胞；KL376:感染过表达MYOC慢病毒的细胞；KL376+NC:阴性对照；KL376+KD:感染针对MYOC的RNAi慢病毒的细胞。

Western blot 检测KD效率 准备靶细胞 慢病毒感染靶细胞 提取感染靶细胞的总蛋白 Western blot 该图显示：靶点感染组（标注为413）相对阴 性对照组（标注为NC），阳性条带更弱，表明靶点组目的蛋白表达水平下调。因此psc413是有效的RNAi靶点。 （CON：未感染过表达MYOC病毒的小梁细胞） 无条带，细胞本底基本不表达MYOC基因，成功构建了小梁细胞模型。

（二） MYOC基因C1009del的定点突变 定点突变技术是蛋白质工程中采用的重要技术之一，它是在已知基因的预定位点通过替换、插入或缺失一定长度的核苷酸片段，精确地改变基因的特定碱基序列，从而研究基因表达调控机制及蛋白质结构与功能的关系，从微观水平上阐述正常状态下基因调控机理及与疾病的关系。

1、构建青光眼相关基因MYOC的C1009del突变 （1） 感受态细胞的制备 （2） MYOC基因C1009del突变质粒载体的构建 对阳性菌落的基因用引物EGFP-N-R进行测序分析，其测序结果如下： 测序结果显示成功完成了MYOC基因C1009del的定点突变 （3）阳性重组体转化入感受态细胞

2、小梁细胞的培养 小梁细胞：来源于本实验室液氮中的保种细胞。 用G418进行细胞筛选 当neo基因被整合进真核细胞DNA后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。 G418的这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。

小梁细胞：来源于本实验室液氮中的保种细胞。 利用不同浓度的G418筛选10天后的单个视野中小梁细胞 正常生长的小梁细胞 （未用G418筛选前） 阴性对照细胞 （未导入突变基因） 含300μl/ml G418的培养基 中的细胞形态 含400μl/ml G418的 培养基中的细胞形态 含700μl/ml G418的培养基 中的细胞形态 含500μl/ml G418的培养基 中的细胞形态

在第14天时观察细胞长势，发现G418终浓度： ≥400μl/ml ，小梁细胞全部凋亡，看不到贴壁细胞； =300μl/ml，尚有贴壁存活的小梁细胞。 因此，决定400μl/ml的G418浓度作为后续筛选导入突变基因的小梁细胞的浓度。

四、动物水平基因功能研究 （一）转基因小鼠模型的构建 （1）构建MYOC基因C1009缺失突变过表达载体 （2）DNA显微注射

DNA显微注射 1. 促排和取卵：人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导母鼠排卵，和雄鼠合笼，用颈椎脱臼法处死有阴道栓的雌鼠，在解剖镜下找出输卵管伞部，解剖出受精卵。 2. 不育雄性公鼠：结扎公鼠 假孕雌性母鼠：在正式实验前，结扎公鼠需与性成熟的雌性小鼠交配，该雌性小鼠为假孕雌性母鼠。 3. 受精卵注射外源DNA：显微操作仪、显微持卵针和显微注射针。 4. 注射后的受精卵移植至受孕后0.5天的假孕母鼠的输卵管内

（二）验证转基因小鼠是否为原发性开角型青光眼模型 （1）测定IOP （2）小梁网细胞及视网膜神经节细胞的退行性改变

（三）功能研究 3. 定期测定IOP，分析IOP改变情况 4. 分析眼部各组织突变基因mRNA表达情况 包括：角膜、巩膜、视网膜、睫状肌、视神经、房水等。 5.分析各组织突变myocilin蛋白表达分布情况 尤其是房水、小梁网细胞内突变蛋白聚集、排列信息 6.分析细胞凋亡与视神经节细胞退行性改变的机制。

技 术 路 线 图

（四）近期任务 1、将明确C1009del突变蛋白的功能、房水循环障碍的机制及其与视神经节细胞凋亡之间的关系，进而阐明MYOC突变对POAG发生的致病机理。 2、早期诊断：制备基因芯片，用作症状前诊断或产前诊断，作为家族性青光眼的基因预警手段。 3、个体化治疗：提供药物治疗的新靶点，作为个体化治疗的理论基础。

发表的论文及获奖情况 [1] Xiaobing Xie, Xin Zhou, Xiying Qu, Jing Wen, Yanli Tian, Fang Zheng.Two novel myocilin mutations in a Chinese family with primary open-angle glaucoma. Molecular Vision, 2008,14:1666-1672 [2] 谢小兵，周新，田艳丽，曲喜英，匡多秀，朱惠斌，喻京生，宁兴旺。原发性开角型青光眼家系的 MYOC基因突变研究。中华检验医学杂志，2009，32（2）：157-161 [3] 谢小兵，周新，田艳丽，曲喜英，匡多秀，朱惠斌。原发性开角型青光眼家系中一个新的 MYOC基因突变。中国现代医学杂志，2008，18（14）：2074-2077 [4] 匡多秀，李萍，周新，曲喜英，朱昕力，谢小兵(通讯作者)。C1009del突变质粒载体的构建及MYOC基因的有效干扰。国际检验医学杂志，2011, 32（5）:529 [5] 匡多秀，李萍，谢小兵(通讯作者) 。针对MYOC基因RNAi慢病毒载体的优化及筛选。实用预防医学杂志，2011,18(10):1987-1990 “原发性开角型青光眼家系的MYOC基因突变研究”项目获2008年度中华医学会第七次全国检验医学学术会优秀壁报奖； 本课题资助项目：湖南省自然科学基金、湖南省科技厅及教育厅科研资助基金。

谢谢！