第四讲 抗肿瘤药物药效学 徐寒梅

药效学试验方法 一、抗肿瘤药物作用机制 二、体外抗肿瘤试验 三、常规体内抗肿瘤试验：小鼠和人 四、生物反应调节剂的试验方法 五、原位移植模型抗肿瘤试验 六、抗肿瘤转移实验 七、抗肿瘤血管新生药物试验

一、抗肿瘤药物作用机制 （一）细胞生物学机制 抗恶性肿瘤药通过影响细胞周期的生化事件或细胞 周期调控对不同周期或时相的肿瘤细胞产生细胞毒 作用，并延缓细胞周期的时相过渡。 分为两大类： 细胞周期非特异性药物（cell cycle nonspecific agents，CCNSA） 细胞周期（时相）特异性药物（cell cycle specific agents，CCSA

（二）抗肿瘤作用的生化机制 1．干扰核酸生物合成 2．直接影响DNA结构与功能 3．干扰转录过程和阻止RNA合成 4．干扰蛋白质合成与功能 5．血管生成抑制剂 (三）分子靶向药物（检索、总结）

二、体外抗肿瘤试验 1．MTT法 【基本原理】 活细胞的线粒体中存在与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷 酸 (NADP)相关的脱氢酶，可将黄色的MTT还原为 不溶性的蓝紫色的甲臜（formazan），在死细胞 中此酶活性消失，MTT不被还原。溶解甲躜后可用 酶标仪在570 nm波长处检测光密度。 结果评价：抑制率=(对照组OD值－给药组OD值)/ 对照组OD值×100%。

2．SRB法 【基本原理】 Sulforhodamine B（SRB）是一种蛋白质结合染料， 粉红色，溶于水。SRB可与生物大分子中的碱性氨 基酸结合，其在515 -540nm的OD读数与细胞数 呈良好的线性关系，故可用作细胞数的定量。 结果评价 测定对照组细胞（C）及受试药组细胞 （T）的OD值，抑制率=(对照组OD值－给药组OD 值)/对照组OD值×100%。

3．集落形成法 【基本原理】 克隆原细胞（clonogenetic cell）持续分裂6代或 以上时，其后代所组成的群体（集落）便含50个以 上细胞。当培养支持物中接种的细胞比较稀疏时， 每个集落彼此不接触，通过集落计数可对克隆原细 胞做定量分析，可准确反映肿瘤细胞暴露于抗肿瘤 药物后，仍能保持持续增殖分裂能力的细胞数，是 一种较灵敏的检测方法。 结果评价：集落抑制率(%) =(1－给药组集落数/对照组集落数)×100%。

三、常规体内抗肿瘤试验 一）、注意事项 给药方案 阳性对照 剂量设计 给药途径 常用的鼠肿瘤和人肿瘤 实验动物

二）移植性肿瘤 （1）腹水瘤 :无菌条件下取荷瘤小鼠的腹 水用无菌生理盐水以适当比例稀释，给每 只小鼠腹腔内接种（1～5）×106个细胞， 一般于接种后24 h开始给药； （2）实体瘤 :皮下瘤模型是最常用的实验 模型，在无菌条件下，将肿瘤接种于小鼠 皮下，其中腋窝部是常见的接种部位。

三）实体瘤接种方法 1）细胞接种法 每只小鼠接种0.2 ml，接种量（5～10）×106个细胞。 2）瘤块匀浆接种法 3）瘤块接种法 用剪刀将肿瘤剪成2 mm3将瘤块送入套管针，经切口 插入小鼠背部皮下，植入瘤块。 4）荷瘤腹水接种法 无菌条件下取荷瘤小鼠的腹水用无菌生理盐水以适当比 例稀释，给每只小鼠皮下接种（1～5）×106个细胞。

四）评价方法 1、腹水瘤模型 生命延长率=(T－C)/C×100%。 C----对照组平均生存时间 T----给药组平均生存时间。 生命延长率大于30%，有效（有统计学意义）。

中位生存时间（median survival time，MST） MST=(中间生存天数－0.5)＋(每组鼠数的中间 数－中间生存天数前死亡的鼠数)/中间生存天 数死亡的鼠数，用(T/C)%表示治疗效果。 (T/C)%=TMST /CMST×100%。 CMST----对照组MST； TMST----给药组MST。 以125%为界，(T/C)%≥125%，视为有效。

2、实体瘤 1）称瘤重法 肿瘤生长抑制率=(空白对照组平均瘤重－ 给药组平均瘤重)/空白对照组平均瘤重 ×100% 抑制率(%)≥40%，有统计学意义时为有效， 并提供相应照片。

2）测量瘤径法 V=(1/2)×a×b2或者V=π/6×a×b×c a、b、c分别表示长宽高。两公式可任选其一。 计算出相对肿瘤体积（RTV）； RTV=Vt/V0 V0------给药前测得的体积 Vt------试验进程中某介时间点测得的体积 相对肿瘤增殖率(T/C)=TRTV/CRTV×100% TRTV-----治疗组RTV CRTV-----空白对照组RTV T/C＞40%无效；T/C≤40%，有效（有统计意义）。

四、生物反应调节剂的试验方法 包括体内抗肿瘤效应确证和免疫功能研究。 巨噬细胞功能测定 天然杀伤细胞活性测定 淋巴细胞转化试验 淋巴因子转化的杀伤细胞活性测定 迟发性超敏反应 体内多种细胞因子测定

五、原位移植模型抗肿瘤试验 【基本原理】 原位移植（orthotopic transplantation），是指将来 源于人类某种组织的肿瘤细胞或组织种植在动物的 同一脏器，如将结肠癌细胞或组织接种在小鼠的结 肠壁等。 优点：更接近临床，药物治疗有接种部位特异的依 赖性。 目前已建立：脑瘤、舌癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、 胰腺癌、肝癌、结肠癌及前列腺癌等。

举例：人肝癌裸鼠原位移植模型 【材料与试剂】 BALB/C-nu/nu裸小鼠，4～5周龄，雌雄各半。动 物饲养在无特定病原菌（SPF）不境。人肝癌裸鼠 原位移植瘤组织及常用手术器械。 【操作步骤】 （1）模型制备 （2）分组给药 （3）观察指标 【注意事项及评价】 （1）模型 （2）生命延长率试验

六、抗肿瘤转移实验-背景介绍 1、基底膜组成成分及功能 2、肿瘤生长方式与生长相关因素 3、肿瘤扩散 4、恶性肿瘤的浸润和转移机制 5、4-类水解酶参与细胞外基质的降解： (1)丝氨 酸蛋白酶(如纤溶酶原激活剂、纤溶酶)；(2)半胱氨 酸蛋白酶(如组织蛋白酶B、G、H)；(3)天冬氨酸蛋 白酶(如组织蛋白酶D)；(4)金属蛋白酶(如胶原酶等)。 6、明胶酶

六、抗肿瘤转移实验 1．肿瘤细胞与基底膜成分的黏附能力测定 【基本原理】 肿瘤细胞通过膜表面受体黏附于基底膜及细胞外 基质的成纤维黏连蛋白（fibronectin，FN）、层 黏连蛋白（laminin，LN）和Ⅳ型胶原蛋白上。细 胞的黏附性能在维持细胞外形、调节细胞分裂及 运动等功能中起十分重要的作用。黏附是癌细胞 侵袭的始动步骤。高侵袭的肿瘤细胞与基底膜成 分的异质性黏附能力通常增高，而肿瘤细胞间的 同质性黏附能力则会下降。

2．重组基底膜侵袭实验 【基本原理】 在肿瘤转移形成过程中，肿瘤细胞侵袭基底膜是重 要环节。Matrigel是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质 成分，含有Laminin，Ⅳ型胶原等，铺在PVPF滤膜 上，能在培养基中重组形成与天然基底膜极为相似 的膜结构。具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下可 穿过滤膜。通过统计穿过滤膜的细胞数可在体外观 察药物对肿瘤细胞侵袭能力的影响。 抑制率(%)=(对照组侵袭细胞数－给药组侵袭细胞 数)/对照组侵袭细胞数×100%

3．明胶酶活性的测定方法 【基本原理】 Ⅳ型胶原是基质膜的主要构成成分，明胶酶（Ⅳ 型胶原酶）是降解Ⅳ型胶原的特异的一种基质水 解酶，其活性与肿瘤细胞侵袭和转移密切相关。 人纤维肉瘤细胞HT-1080能分泌分子量为72 kD和 92 kD的两种明胶酶。收集细胞培养上清即可获 得。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可将这两种明胶 按分子量大小分开，显示两条负染带，根据带的 亮度和宽度可判断药物对明胶酶活性的影响，用 于抗侵袭和转移药物的作用及机理研究。

4．癌细胞趋化性运动能力的测定 【基本原理】 肿瘤细胞与母体瘤分离，穿越血管壁，侵袭周边 正常组织时，需要一定的运动能力。高转移的肿 瘤细胞通常具有较强的运动性。 细胞外基质成分层黏连蛋白、纤维黏连蛋白（FN） 和一些生长因子对肿瘤细胞有趋化作用，可使其 发生定向运动。 用FN作为趋化剂，诱导肿瘤细胞穿越带微孔的滤 膜。计数穿过滤膜的细胞即可定量地反映肿瘤细 胞的运动能力，以及评价药物对细胞运动性能的 影响。

5．B16-BL6小鼠黑色素瘤自发性转移模型 【基本原理】 黑色素瘤B16是1954年发现的C57BL/6小鼠 耳根部皮肤的自发性肿瘤。此瘤株主要特点是能 够发生肺转移。B16-BL6细胞来源于B16，具有 高转移能力。 将瘤细胞移植于局部，瘤体增殖生长后，侵 袭周围正常组织和血管，进入血液循环，到达远 处部位发生转移，称为自发性转移。 此模型可反映出侵袭→血行播散→侵袭的完 整转移过程，用于观察药物对肿瘤侵袭和转移能 力的影响。

6．Lewis肺癌自发性肺转移模型 【基本原理】 Lewis肺癌是Lewis于1951年在一只C57BL/6小鼠 上发现的，为自发性肺内未分化上皮样癌。移植 瘤主要通过血行播散在肺部形成转移灶。Lewis肺 癌移植于动物皮下、肌肉、及爪垫等特定部位， 移植瘤增殖后开始侵袭周围的正常组织和血管， 继之癌细胞进入血液循环被转移到靶器官、黏附 于靶器官的血管壁上并穿出血管，癌细胞增殖成 为克隆，最后形成癌转移瘤。上述过程基本类似 于人类肿瘤从生长到转移瘤形成所经历的一系列 步骤，故称之为癌的自发性转移模型。它可用于 癌转移机理探讨和抗癌转移药物的筛选及研究。

七、抗肿瘤血管新生药物试验 1．鸡胚绒毛尿囊膜 【基本原理】 观察药物对鸡胚尿囊膜局部血管新生的影响可以 用来间接地衡量药物影响肿瘤诱生新生血管或实 体瘤组织内血管生成的能力。 【结果评价】 ①不影响血管新生（－），即甲基纤维素薄片覆 盖区域血管生成正常； ②影响不明显（±），即无血管区直径不超过2 mm；③明显抑制血管新生（＋），直径达4 mm 或更多。

2．大鼠动脉无血清培养微血管样结构 【基本原理】 体外定量测定新血管生成的实验模型。将大鼠主 动脉段包埋于纤维蛋白胶中，用MCDB131无血 清培养液进行体外培养，内皮细胞从动脉段切口 处向外生长，形成具有分支的微血管样结构。于 不同天数，在倒置显微镜下计数微血管样结构的 数量，即能动态、定量地反映血管生成的情况。

Matrigel血管生成试验 内皮细胞迁移试验

思考题 1、在SFDA网站找到《细胞毒类抗肿瘤药物非临床 研究技术指导原则》，摘要出抗肿瘤药物体内外 活性试验应该遵循的原则。 2、抗肿瘤药物作用机制 3、MTT试验的原理、注意事项 4、什么是生物反应调节剂 5、抗肿瘤转移实验种类、原理

 人与动物用药量换算 人与动物对同一药物的耐受性是 相差很大的。一般说来，动物的耐受性要比人大，也就 是单位体重的用药理动物比人要大。 可以采用人与动物的体表面积计算法来换算： 人体体表面积计算一般认为许文生氏公式（中国生理学 杂志12:327,1937）尚较适用，即： 　　体表面积（m2）=0.0061×身高（cm） +0.0128×体重(kg)-0.1529 　　例：某人身高168cm，体重55kg，试计算其体表 面积。 　　解： 0.061×168+0.0128×55.0.1529=1.576m2

如：人的临床剂量为 X mg/kg , 换算成大鼠的剂量： 大鼠的剂量＝X mg/kg×70kg×0 如：人的临床剂量为　X mg/kg ,　换算成大鼠的剂量： 大鼠的剂量＝X mg/kg×70kg×0.018/200g＝X mg/kg×70kg×0.018/0.2kg＝6.3 X mg/kg. 这也就是说，按单位体重的剂量来算，大鼠的等效剂量相当于人的6.3倍。