槐花米中芦丁的提取、分离 和鉴定 制作人：熊 燕
一、实验目的要求 1、掌握黄酮类化合物的提取和分离的原理和方法。 2、掌握黄酮类成分的主要理化性质及鉴别方法。 3、了解IR及NMR在黄酮类化合物结构鉴定中的应用。
二、实验原理 中药槐米中的主要化学成分 主要含有芦丁、槲皮素，还含少量皂苷类及多糖、粘液质等。 槐米含芦丁可高达23.5%，槐花开放后降至13.0%。 芦丁可用于治疗毛细血管脆性引起的出血症，并用作高血压辅助治疗剂。 芦丁还可以作为制备槲皮素、羟乙基槲皮素、羟乙基芦丁、二乙胺基乙基芦丁等的原料。
槲皮素的化学结构式 芦丁的化学结构式
芦丁的性质 芦丁为浅黄色粉末或极细微淡黄色针状结晶，含3分子结晶水（C27H30O16·3H2O），加热至185℃以上熔融并开始分解。 芦丁可溶于乙醇、吡啶、甲酰胺、甘油、丙酮、冰醋酸、乙酸乙酯中，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚。 芦丁的溶解度，在冷水中1:10000，沸水中1:200，沸乙醇中1:60，沸甲醇中1:7 芦丁分子中具有较多酚羟基，显弱酸性，易溶于碱液中，酸化后又可析出，因此可以用碱溶酸沉的方法提取芦丁。
碱溶酸沉法原理 由槐花米中提取芦丁的方法很多，本实验是根据芦丁在冷水和热水中的溶解度差异的特性进行提取和精制，或根据芦丁分子中具有酚羟基，显弱酸性，能与碱成盐而增大溶解度，以碱水为溶剂煮沸提取，其提取液加酸酸化后则芦丁游离析出。
三、实验流程 1、芦丁的提取 槐花米（15g） 搅拌下加入石灰乳 保持微沸30min 加水300ml 调节PH8-9 1.5g CaO 加10ml水 直火加热 双层滤纸趁热抽滤 在60-70度下，用浓盐酸调PH3-4 滤液 静置 趁热抽滤时，注意防止滤液因减压而沸腾。 残渣
2、芦丁的精制与水解 滤液 重结晶 水解 精制芦丁 槲皮素 第一次实验所得滤液 抽滤 沉淀（粗品芦丁） 均分2份 酸水解过程中，注意补充蒸馏水，维持原体积。 2%的硫酸用98%浓硫酸自己配制，注意浓硫酸和水的加入顺序。 抽滤 沉淀（粗品芦丁） 均分2份 滤液 重结晶 水解 按1:70量加入2%硫酸，加热40min，放冷静置，抽滤 按1:60量加入蒸馏水，沉淀悬浮于蒸馏水中，加热煮沸15分钟后，趁热抽滤 滤液 滤液 沉淀 残渣 冷却 静置，抽滤 干燥、 95％乙醇重结晶 糖鉴定 抽滤时，热烧杯勿直接放在实验台上，防止烧杯炸裂。 精制芦丁 槲皮素
3、芦丁、槲皮素的理化鉴别方法 实验名称 实验试剂 现 象 芸香苷 槲皮素 Molish反应 10%α-萘酚乙醇、溶液-浓硫酸 紫色环 现 象 芸香苷 槲皮素 Molish反应 10%α-萘酚乙醇、溶液-浓硫酸 紫色环 无现象 盐酸-镁粉反应 盐酸-镁粉 红色～紫红色 醋酸镁反应 1％醋酸镁甲醇溶液 黄色荧光（紫外灯） 三氯化铝反应 1％三氯化铝乙醇溶液（紫外灯） 黄色荧光 锆-柠檬酸反应 2％二氯氧锆甲醇溶液2％柠檬酸甲醇溶液3～4滴 黄色并褪色 黄色不褪色
显色剂：①喷三氯化铝试液，待乙醇挥干后，置紫外灯(365nm)下观察。 4、芦丁的TLC鉴定 样品： ①自制芦丁乙醇液; ②自制槲皮素乙醇液。 对照品：①芦丁对照品乙醇液; ②槲皮素对照品乙醇液。 吸附剂：聚酰胺薄膜。 展开剂：①氯仿—甲醇—甲酸(15：5：1); ②醋酸乙酯—甲酸—水(8：1：1)。 显色剂：①喷三氯化铝试液，待乙醇挥干后，置紫外灯(365nm)下观察。
样品：自制芦丁。 实验：KBr压片，红外分光光度仪测试。 IR谱图与芦丁标准谱图对照。 DMSO-d6作溶剂，测芦丁的1HNMR。 5、芦丁的IR、1HNMR鉴定 样品：自制芦丁。 实验：KBr压片，红外分光光度仪测试。 IR谱图与芦丁标准谱图对照。 DMSO-d6作溶剂，测芦丁的1HNMR。
四、注意事项 在提取前应将槐花米粉碎，使芦丁易于被热水溶出。粉碎不可过细，以免过滤时速度过慢； 本实验用碱溶酸沉法提取，加入石灰乳可以达到碱性溶解的目的，又可除去槐花米中所含的大量粘液质，但应严格控制其碱性pH8～9，不可超过pH10。如pH值过高，加热提取过程中芦丁可被水解破坏，降低收得率。加酸沉淀时，控制pH3～4,不宜过低，否则芦丁可生成佯盐而溶于水，也降低收得率。
五、思考题 苷类结构的检识大体程序如何？ 苷类水解的方法？ 怎样确定芦丁结构中的糖基是连接在槲皮素3-OH上？ 苷元的结构怎样确定？ 怎样确定苷键的构型？
六、实验课后总结与讨论 芦丁提取 芦丁的分离纯化 芦丁的理化鉴别 芦丁的苷元-槲皮素的制备 芦丁与槲皮素的波谱鉴定