转基因动物和动物克隆 一、转基因动物（概念、研究、问题） 二、转基因的“动物药厂” 三、抗感染动物 四、转基因动物技术路线中的转基因胚胎干细胞 五、基因敲除的小鼠模型（概念、方法、特点、应用） 六、克隆羊和动物克隆（概念、意义） 七、克隆人

世界第一只转基因动物 世界首只转基因灵长类动物 ——-安迪

一、什么是转基因动物 转基因动物是指用实验导入的方法将外源基因在染色体基因内稳定整合并能稳定表达的一类动物。（包括基因敲除的动物）

动物基因工程的发展状况与趋势 动物基因工程的实质是改变动物的遗传组成，增加动物的遗传多样性，赋予转基因动物新的表型特征，使能够更好地服务与人类社会。

1、从简单的显微注射法向高效率的转基因体细胞核移植方向发展 从转基因的技术手段来看，除DNA显微注射法外，人们先后试过反转录病毒载体介导法、精子介导法、胚胎干细胞介导法和核移植法等多种转基因方法。 转基因细胞的核移植技术已经成为转基因动物生产的主流方法。

2、从外源基因随机插入（或整合）到定点整合的转变 转基因在基因组中的存在方式有两种，即随机整合和定点整合。 2、从外源基因随机插入（或整合）到定点整合的转变 转基因在基因组中的存在方式有两种，即随机整合和定点整合。

为了达到外源基因的高效表达，在转基因结构上增加了含有位点控制区（LCR）、核基质附着区(MAR)等调控元件，可以实现插入位点非依赖性、拷贝数相关的表达模式。LCR和MAR的功能不受种属差异的限制，无论外源基因插入什么位点，都能够维持一个开放的染色体结构，有利于基因的表达。 基因打靶技术的出现与发展，实现了对目的基因的定位操作。

３、从传统转基因到条件控制的转变 从转基因的策略来看，动物转基因技术的发展经历了两个阶段：第一阶段为传统转基因动物阶段，第二阶段为条件性转基因动物阶段。 　　　借助转基因技术可将单一的功能基因和基因簇引入高等动物的基因组，或将目的基因从动物基因组中敲除，实现了种系内和种系间基因转移或修饰，产生新的基因型和表型。 　　 目前转基因动物主要应用在生物学基础研究、医学疾病模型、动物生物反应器、异种器官移植、动物遗传改良等５个方面。

 转基因动物的技术路线 经典的技术路线  目的基因 显微注射   已交配的 取出 移植 受体动物 妊娠 供体动物 受精卵 输卵管 转基因动物 缺点：注入目的基因的命中率低，目的基因的整合率低，受精卵移植的受孕率低。

优点：受精卵的成活率高达90％以上，外源基因整合率高，提高受孕率。  整合胚胎移植的技术路线 转基因动物 受体动物子宫 目的基因 非手术 胚胎移植   体外受精 体外培养 多细胞胚胎 检测 整合外源基因 卵子 受精卵 或囊胚 的胚胎 精子 优点：受精卵的成活率高达90％以上，外源基因整合率高，提高受孕率。

核移植（克隆）的技术路线 目的基因 转基因动物 导入 核移植（克隆）的技术路线 目的基因 转基因动物  导入   . 动物胎儿成纤维细胞 妊娠 取核   动物 去核 重组的 体外培养 囊胚期 胚胎移植 卵细胞 受精卵 胚胎 受体动物子宫

转基因动物技术的主要步骤 获取外源目的基因 外源目的基因与专性基因表达启动子、增强子、报告基因等构件的拼接重组。 外源重组目的基因导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物 转基因胚胎的发育及鉴定 筛选所得的转基因动物

一、转移基因 (一)转移基因的原理：转基因技术的理论基础在于各种生物的遗传密码都是统一的。都是以3个碱基决定一个氨基酸这样的密码形式贮存在DNA链上，各物种间形状的不同仅仅是由于DNA上的四种核苷酸排列次序的不同，同时各种生物从DNA到蛋白质合成都服从“中心法则”, 当一个物种的细胞内加入另一物种或人工合成的DNA(即基因)后就可能产生新的性状。

(二)基因的获得：取自现有的生物体如病毒、细菌、体细胞或肿瘤细胞的DNA,用限制内切酶或外切酶把DNA切割成若干小段,然后再把这些小段利用连接酶分别放入载体中,并建成克隆载体。 基因的片断可随载体复制，有时亦可表达，用DNA 或抗体探针做分子杂交试验或ELISA试验筛选出带有理想基因的克隆,再把理想基因载体放入大肠杆菌等宿主细胞中扩大、增殖,或采用PCR的方法扩增。再对扩增的DNA片断进行适当修饰,例如将一个单一的基因与经选择的启动子重组合，然后进行转移，或将特定的控制序列连接到目的基因的结构序列上，从而创造1个新的重组基因,然后再进行转移。

理想基因也可用人工合成的办法获得，要合成一特定的基因，就是要合成具有一定排列顺序的DNA，DNA上四种碱基的配对是非常严格的,腺嘌呤(A)必定和胸腺嘧啶(T) 配对，鸟嘌呤(G)必定和胞嘧啶(C)配对，由于蛋白质合成不是直接以DNA作为模板,而是以DNA的副本mRNA作为模板，在RNA中，用尿嘧啶(U)代替了胸腺嘧啶(T)。

二、基因转移的受体细胞

(一)原生殖细胞：禽类的原生殖细胞容易分离、培养和冷冻，所以，这种受体细胞在禽类动物较易实现。 (二)配子：配子能把自身携带的基因组全部信息和外源插入基因序列，完整地贡献给合子。由于精子可用作有效的转移载体，所以，可以精子作为目的基因的受体。较多的是用重组病毒直接感染精子，精子即可把外源基因传到合子。

(三)受精卵或胚胎内细胞团：精卵结合形成的单细胞受精卵，是最常用的外源基因转移的受体；受精后的早期胚胎及囊胚期稍后的胚胎含有的内细胞团，该细胞团内含有未分化的胚胎干细胞，也可认为是全能的，或至少是多能性的，所以，用该时期的内细胞团或囊胚期的细胞作为外源基因的受体细胞，也可望达到基因转移的目的。 但这种情况下制备的转基因动物多为嵌合体。

三、实验动物的准备 主要叙述制备转基因鼠的实验程序。 (一)不育雄性公鼠:结扎公鼠与母鼠交配以后产生假孕母鼠。受结扎的公鼠需8周以上，对种系无特殊要求。在正式实验前，结扎公鼠需与性成熟的雌性小鼠交配，反复交配两次或三次，经检查雌体有阴道栓，但均不怀孕产仔，则证明结扎成功。结扎公鼠使母鼠产生阴道栓的能力可维持2年。值得注意的是，如结扎公鼠与母鼠交配4～6 次均不能产生阴道栓，则该公鼠必须更换。

(二)假孕雌性母鼠:作为获得外源基因即转基因胚胎的养母，要求6周龄至5 个月较合适，对种系无特殊要求。其生殖系统的生理状态应与移进胚胎的发育阶段同步化，从而为移植胚胎提供着床和继续发育的生理条件。将选好的成年健康雌性个体与不育雄性个体进行交配，时间应与供体(取受精卵的雌体)同时进行。一般为下午4点钟合笼,次日晨选有阴道栓的待用。

(三)取受精卵的雌性母鼠：如果无特殊遗传背景的要求，一般用杂交F1受精卵较为理想。因杂交F1代胚胎的发育能力和对外环境的耐受能力都较强，有益于提高移植胚胎的出生率。

在对遗传背景有特殊要求的情况下，供卵母鼠需选择种系，例如把一种鼠的等位基因转移到另一种不同等位基因的种系，这种卵供体母鼠必须有特定的遗传背景，因此需用纯系鼠。 在实际操作中，一般用4～6周母鼠作为超排卵供体，3～4周母鼠产卵更多但卵细胞膜脆性较大，在处理过程中易破裂，而6周以后母鼠产卵逐渐减少。

四、基因导入的方法 (一)显微注射法：在显微镜下，可借助显微操作仪，将毛细玻璃管直接插入受精卵的雄原核中(较大的原核),注入特定的外源基因,即为基因显微注射法。下面把利用显微注射法制备转基因鼠的方法和步骤简述如下。

1. 超数排卵(超排)与取卵 (1)超数排卵：在雌性动物发情周期的某一阶段,用促性腺激素促使卵巢里大量卵泡成熟并排出，称超数排卵。影响母鼠超排因素有母鼠的性成熟程度、营养、体重及母鼠种系。超排的最佳时间随种系不同而异,一般在3～5周，超过6周超排卵数明显减少。

在实际操作中常取4～6周龄的母鼠作超排卵供体，腹腔注射孕马血清(PMS) 和人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导母鼠排卵。PMS模拟卵泡刺激素(FSH)作用，hCG模拟黄体生成素(LH)的作用。二者注射时间间隔为42～48h，排卵发生在注射hCG后10～13h,注射剂量为每鼠5～10u。为了实验方便，常在下午注射PMS，隔日同一时间注射hCG，注射hCG 后每只母鼠置于一个单独饲养的正常公鼠笼内，次日晨检查阴道栓。

(2)取卵：用颈椎脱臼法处死有阴道栓的雌鼠，把完整的输卵管带一小段子宫剪下,置于PBS平衡盐溶液中，在解剖镜下找出输卵管伞部，用带4号针头的注射器将受精卵冲出，立即将卵子换至新鲜培养液内洗涤3～4次即可用于显微注射。

2. 注射外源DNA：显微注射需用显微操作仪，用来控制显微持卵针和显微注射针。持卵针是显微注射时固定受精卵的细玻璃管，管口平滑，通过一注射器控制持卵针，使其吸住要进行注射的受精卵。用来注射外源DNA的细注射针管表面平滑，尖端锋利,便于注射时穿过透明带、细胞膜等。

取已制备好的受精卵细胞和外源DNA悬液,在倒置显微镜下做显微注射。注射时先用持卵针吸住受精卵，再用注射针吸取外源DNA悬液,然后推动注射针，使其刺入受精卵的雄原核，将DNA注入。注射完毕，慢慢抽出注射针,将受精卵放入新的培养液中，使其恢复。一般50～80％的受精卵在显微注射后仍保持健康。（P120）

3. 注射后受精卵(或胚胎)的移植：注射后单细胞至桑椹胚的卵(受精后0. 5天到3. 5天)移植至受孕后的0 3. 注射后受精卵(或胚胎)的移植：注射后单细胞至桑椹胚的卵(受精后0.5天到3.5天)移植至受孕后的0.5天的假孕鼠的输卵管，输卵管移植需用被透明带包裹的卵。也可将注射有外源DNA的受精卵或桑椹胚体外培养至囊胚，再行移植。显微注射后3.5天的囊胚移植至受孕后2.5天的假孕鼠子宫，子宫移植不需要有透明带。

此法的优点是，在一定设备和经验条件下，实验过程大为简化；任何DNA 顺序都可直接导入原核内,导入的外源DNA在卵裂前与受体基因组整合,其缺点在于导入的外源DNA通常以多拷贝串联的形式随机地整合于受体基因组中，妨碍其表达的正常调节。

(二)逆转录病毒感染法：以逆转录病毒作载体， 把重组的逆转录病毒载体DNA包装成高滴度病毒颗粒，感染发育早期的胚胎，将外源基因导入宿主的染色体内的方法称为逆转录病毒感染法。此法操作简单，可通过注射将重组病毒转移到囊胚腔内，也可将去透明带的胚胎与分泌重组病毒颗粒的细胞共培养，以达到将外源DNA 转移到胚胎中去的目的。

这一方法的优点是，重组逆转录病毒可同时感染大量胚胎。感染后的整合率高； 外源DNA在受体细胞基因组中的整合通常是单拷贝的； 不需要昂贵的显微注射设备。 本法的缺点是，由于选用的受体是早期胚胎，不是受精卵，致使外源DNA 在动物各种组织中的分布不均,不易整合到生殖细胞中；由于病毒衣壳大小有限,限制了被导入的外源 DNA的大小，一般不超过15Kb。

(三)胚胎干细胞介导法： 干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称之为“万用细胞”。 干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。它包括胚胎干细胞和成体干细胞。干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。

胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES）：是胚胎发育期的胚细胞，可以人工培养增殖并具有分化成其它类型细胞的功能。

ES细胞的全能性指ES细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力，即ES细胞具有发育成完整动物体的能力，可以为细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的试验材料。

ES细胞的形态学特征 ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞核大，有一个或几个核仁，胞核中多为常染色质，胞质胞浆少，结构简单。体外培养时，细胞排列紧密，呈集落状生长。用碱性磷酸酶染色，ES细胞呈棕红色，而周围的成纤维细胞呈淡黄色。　

细胞克隆和周围存在明显界限，形成的克隆细胞彼此界限不清，细胞表面有折光较强的脂状小滴。细胞克隆形态多样，多数呈岛状或巢状。 小鼠ES细胞的直径7 μm～18 μm，猪、牛、羊ES细胞的颜色较深，直径12 μm～18 μm。

采用这一方法的优点是，外源DNA的整合率高； 整合在生殖细胞中的比例也很高。缺点是，ES细胞株不易建立，长期培养后出现细胞分化现象；生产的转基因动物都是嵌合体。

(四)精子载体法 将外源DNA与精子一起孵育，精子可捕获外源DNA，并通过受精过程将外源DNA导入受精卵。此法不仅可免去复杂而昂贵的设备， 且可省去不少繁杂的操作和条件准备。但该法有些结果不能重复。 此外，还有一些其它的方法，都有不同的优缺点。

(五)基因敲除的小鼠模型的建立方法 基因敲除是向正常生物个体内引入某个突变基因位点而选择性地使某特定基因功能失活的技术. 可培养出靶向性剔除某基因的小鼠，而导致行为特性改变。

培育基因靶向性敲除小鼠的实施步骤为： 1.首先将某基因突变位点经同源重组引入小鼠ES细胞。 2.将含有靶向敲除的突变基因位点的ES细胞注入小鼠早期胚胎中, 孕育出嵌合小鼠, 此嵌合小鼠体内胚系细胞群和体细胞群都会有来自ES细胞和受者胚胎鼠细胞的DNA。

3.检测嵌合小鼠交配后的生殖细胞内是否整合有突变的基因位点。 4.在各只敲除的突变基因位点杂合性小鼠之间交配, 以产生纯合性基因敲除小鼠。

特点 培养成功率低，技术难度大，尽管对研究遗传与疾病的相关性十分有用，但若敲除致命的功能基因，可使胚胎早期发生死亡。若所敲除基因可被其他功能基因代偿，则使表型改变模糊不明，有局限性。

（六）细胞核移植法

核移植也称克隆或无性繁殖，是将分离的胚胎卵裂球(核供体)或体细胞核与成熟并去核的卵母细胞或去核的原核期受精卵的去核胚胎(核受体)融合，不经过有性繁殖过程，连续不断地复制遗传上相同的胚胎，并通过克隆胚胎的移植生产大量同基因型的克隆动物系或动物群的一项动物繁殖新技术。

小结 方法 显微注射 核移植 胚胎干细胞 逆转录病毒 基因敲除 精子介导 优点 外源基因整合效率较高，不需要载体，目的基因的长度可达100Kb 转基因效率高；预测基因表达水平；可以使用定点整合技术 外源DNA的整合率高； 整合在生殖细胞中的比例也很高。 可在整合点整合转移基因的单个拷贝； 该方法简单、方便 缺点 精密仪器， 技术操作较难，易造成宿主动物基因组的插入突变 供体细胞易衰老 ES细胞株不易建立，长期培养后出现分化现象；生产的转基因动物都是嵌合体 插入的基因有大小限度；嵌合性很高；外源DNA 在动物各种组织中的分布不均 应用具有一定局限性 有些结果不能重复

五、转基因鼠的检测 待假孕母鼠产出幼仔后,可用幼鼠尾巴提取DNA;对于一些基因调控研究,需要尽快获得信息而暂不需保留转基因鼠，从胎鼠组织或幼鼠尾巴提取的DNA,可用PCR、Dot blot (斑点杂交)、Southern blot(Southern转移)等多种方法分析以确定是否转基因鼠。

六、基因转移后的存在方式及表达 (一)外源基因导入后的存在方式：外源基因被导入受体细胞后，在受体细胞内的存在方式有三种： 1. 非同源重组。大多数外源基因导入受体细胞后,与受体细胞染色体的某一位点随机整合，这样可带来正常基因的插入、缺失、易位等突变。 2. 同源重组。导入的外源DNA与受体细胞染色体的DNA 通过顺序取代或顺序插入实现同源重组。通过同源重组有可能导致受体细胞正常的基因发生突变，当然，也有可能代替原来的有遗传缺陷的遗传基因，从而纠正遗传缺陷。

3. 游离存在。外源基因没有整合到受体细胞中,而是以附加体的形式游离在受体细胞内，能自我复制，并能100％的传给下一代。

(二)外源基因导入后的表达：外源基因导入受体细胞后能否表达，是受许多因素影响的。 1. 外源基因本身的结构和性质。 2. 附带的原核载体顺序。研究发现，原核载体的存在对α-甲胎蛋白、β- 珠蛋白等基因的表达具有明显的抑制作用，而对免疫球蛋白和胶原蛋白基因的抑制不明显。

3. 染色体位置。 外源基因在受体动物细胞染色体上整合部位的基因环境对外源基因表达的影响很大。 4. 甲基化。被转移的基因容易甲基化而失活。 外源基因在受体细胞中的表达方式表现为组织特异性和发育阶段特异性。组织特异性表达是由于某些调节元件如启动子和增强子的作用造成的。

 转基因动物的应用研究 改良动物经济性状的尝试 试图通过转移单个基因改良动物经济性状的研究，至今仍未见成功的报道，尚需对性状表现的生化代谢途径，有关基因的相互作用以及基因定位整合，基因定量表达、组织特异性表达等进行深入的研究。

乳腺生物反应器的研究 1987年，Gordon首次报道小鼠乳腺中表达tPA蛋白。至今国际上转基因羊、转基因牛等的成功报道实例已有10多种，生产出抗胰蛋白酶、乳铁蛋白、人凝血蛋白因子Ⅷ、蛋白质C等药用蛋白。国外经济学家预期，10年后，转基因动物生产的药物销售额超过250亿美元。

基因药物生产 基因药物生产第一阶段是细菌基因工程，第二阶段是动物细胞基因工程，第三阶段是转基因动物—乳腺生物反应器。具有以下特点： ⑴乳腺是自我封闭系统，乳腺表达的蛋白质不回流到血液循环系统，避免外源基因表达的蛋白质对动物本身的影响；

⑵乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器。一头奶牛一年可生产乳蛋白250—300Kg，一只绵羊或山羊一年可生产乳蛋白25—30Kg。如果有百分之一的乳蛋白代换成医用蛋白，产量十分可观。

⑶乳腺分泌的基因产物不但产量高，而且易提纯。表达的蛋白经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。生物活性接近天然产品。 ⑷在动物乳腺表达的外源基因可以遗传，可用常规技术繁殖生产群体。

转基因动物研究存在的问题 转基因动物的低效性 转入基因引起完整基因突变 转入基因表达混乱 病毒转基因对宿主的影响 转基因动物模型与预期不符 乳腺反应器的完善 转基因动物及产品的认可

动物克隆的重大意义 动物克隆技术不仅理论上有重大突破，无需有性繁殖即可生产动物，而且可利用克隆羊技术来克隆人体器官，有医学价值，还可使难以生殖或即将灭种的动物（如熊猫）采用无性繁殖方式来繁殖后代，因此引起全世界关注。现又有克隆牛、克隆猪、克隆羊的问世，现在正在克隆熊猫。