血液学一般检验：概论 医学检验系临检教研室 陈丽华

补充：绪言

一、临床检验的历史和现状

Physician studying urine, with four patients(15th) 古代:感官检查 （如：尿液－中世纪）

尿轮(urine wheel)的发明;

17世纪:荷兰Leeuwenhoek发明显微镜

20世纪末以来:自然科学基础学科与医学基础学科结合－电脑化、自动化、微量化

21世纪：现代信息网络技术（远程诊断）与系统生物工程（包括分子生物学）、临床医学结合。

最常用的临床检验，借助先进的检测技术，对来自离体的血液、尿液、粪便以及分泌物和排泄物等标本进行理学、化学、病原学和显微镜形态学的检查，以简便、快速的检测结果，基本满足临床医学检验筛检疾病的需求。

本课程的特点 项目多联系少 理解易记忆难 实践操作是关键 基础实用须重视

二、临床检验特点 1. 已进入仪器检验的时代 （1）速度快 （4）参数多 （2）精度高 （5）易质控 （3）操作易 （6）信息大

分析前 2.需要实施全程质量保证 分析中 分析后 3.需要合格的检验人员和标准化的检验方法 4.现代仪器检验更强调生物安全。

三、临床检验基础教学目的 1.为疾病诊断和鉴别诊断提供实验室检查客观依据 例：anemia 依据：血中红细胞和血红蛋白量减少 leukemia 依据：血象和骨髓象 肾脏有实质性损伤的依据 尿液中出现蛋白、细胞管型

2.为分析病情、观察疗效、判断预后提供依据 在疾病过程中，血液、体液、分泌物和排泄物也 会随之发生相应的变化 3.为预防疾病提供资料 如血象和肿瘤细胞学的普查等 4.为科学研究提供医学检验基本数据、基本检验方法和操作技能。

四、临床检验的一般方法 1、目视检查 直接观察标本：颜色、透明度、性状，有无 凝块或寄生虫 2、理学检查 液体的相对密度、血液粘度、红细胞沉降 率、红细胞比积等病理变化 3、化学检查 定性和定量检测标本化学成分的病理变化 观察有型成分的数量和形态 4、显微镜检查 5、自动化仪器检查 电子技术、程序控制的发展

五、学好临床检验基础基本要求 1.掌握检验的基础理论； 2.掌握检验的基本技能； 3.熟悉检验方法学的评价； 4.了解检验项目的参考值； 5.熟悉检验项目的临床意义，用循证检验医学的新思维指导临床检验。

六、注意事项 1.在运用实验结果协助诊断疾病时，必须结合临床进行全面分析，动态观察, 其理由: 2.当实验结果与临床不符合时，则更应重视临床并进行动态观察。

第一章第一节：概论

目的要求 1、掌握：毛细血管采血；抗凝剂的种类及选择；血涂片制作、瑞氏染色的原理、方法、质量控制和方法学评价 2、熟悉：静脉采血、真空采血

重点： 1、掌握毛细血管采血 2、掌握血片的制备及染色 难点: 1、抗凝原理及抗凝剂的选择 2、静脉采血

血液学一般检验的用途 1.协助诊断及鉴别诊断； 2.病情观察和预后判断； 3.某些治疗的监护； 4.术前准备； 5.协助传染病和职业病的调查。

一、血液生理概要

1.血液的组成 红细胞 白细胞：N,E,B,L,M 血细胞（45%） 血小板 血液 固体成分（8%~9%）：血浆蛋白、无机盐、脂类等 血浆（55%） 红细胞 白细胞：N,E,B,L,M 血小板 固体成分（8%~9%）：血浆蛋白、无机盐、脂类等 水（91%~92%）

血浆与血清 血浆:血液加抗凝剂后分离出来的淡黄色液体称为血浆； 血清：离体后的血液自然凝固后，分离出来的淡黄色透明液体称为血清。 血清与血浆比缺少某些凝血因子，如凝血因子Ⅰ（纤维蛋白原）、Ⅱ（凝血酶原）、Ⅴ、Ⅷ等。

2.血液主要的理化性质 （1）血量：70±10ml/kg体重，成人约4~5升，约占体重的6%~8%。 （2）颜色:来自于Hb。动脉血鲜红色，静脉血暗红色。 （3）红细胞在血浆中的悬浮稳定性：Zeta电位

（4）粘滞性：主要取决于血细胞比容和血浆粘度。健康成人的全血粘度为N.S.粘度的4~5倍，血浆粘度为N.S.粘度的1.6倍左右。 （5）比重和渗透浓度： 比重 男性：1.055~1.063，女性：1.051~1.060. 渗透压：290~310mOsm/kg·H2O

（6）pH：7.35~7.45，动脉血pH值7.40，静脉血pH值7.35。 （7）凝固性：由于凝血因子被激活，血液离体后会自行凝固。

3.血液的功能 （1）运输功能：为血液的基本功能。 （2）协调功能：激素、酶类 （3）维护机体内环境稳定 （4）防御功能：白细胞、抗体、补体、细胞因子具有免疫功能；血小板、凝血因子起止血和凝血作用。

二、血液标本采集

（一）标本采集的一般要求 1.检验申请单； 2.标本采集和处理具体要求； 3.标本信息完整性； 4.标本拒收。

（二）血液标本类型 1.全血 静脉全血 动脉全血 毛细血管全血 3.血清：与血浆比较，缺乏纤维蛋白原。 2.血浆 4.分离或浓缩的血细胞成分

图1 血液标本类型

（三）血液标本采集方法 皮肤采血 静脉采血 1.按采集部位分 动脉采血 普通采血法 2.按采血方式分 真空采血法

一）皮肤采血法（毛细血管采血法） 1.采血部位：一般采用手指（中指或无名指尖内侧）或耳垂，婴幼儿可用拇指或足跟，特殊人员视情况而定。

2.器材：1）微量吸管：以下两种任选一种 ①Hb吸管； ②一次性毛细玻管 2）消毒用品：75%乙醇棉球、干棉球 3）一次性采血针

3.采血方法：按摩 消毒，干燥 进针 弃第一滴血 吸取血液 止血 4. 注意事项：①生物安全，挤压力度（约3mm深） ②动作要快。 ③多项检查时，采集标本顺序为：Plt、 RBC、 Hb、 WBC、 DC。

二）静脉采血法 1.普通采血法 （1）器材准备：试管、注射器、消毒器材 （2）采血部位：主要是肘静脉。还可以在：手背部手腕部等。幼儿可采用颈外静脉采血。

（3）操作：扎压脉带 消毒，进针 ，松压脉带 抽血 按压，拔针 继续按压数分钟 （4）注意事项： ①若病人晕针，应立即拔出针头，让病人平卧，必要 时可给病人嗅吸芳香酊或针刺人中和合谷穴位，或给 予糖水口服。

②防止标本溶血：容器清洁、干燥；轻轻推注血液；压脉时间不宜太长，抽血速度不宜太快；与抗凝剂混匀时不宜用力振荡；离心速度不宜太快。 ③以空腹采血为主。 ④出血性疾病要用硅化或塑料胶管。

⑤切忌将注射器内气泡推回血管。 ⑥应注意无菌操作。 2.真空采血法

两种采血方法的区别 毛细管采血法 静脉采血法 采血部位 手指、足跟 肘部静脉（浅表静脉均可） 采血器材 专用采血针 注射器，真空采血器 毛细管采血法 静脉采血法 采血部位 手指、足跟 肘部静脉（浅表静脉均可） 采血器材 专用采血针 注射器，真空采血器 采血量 少，<0.1ml 多，>0.2ml 适用范围 需血量少的项目 需血量多（或）少的项目 注：两种方法结果有不同程度的差异。如静脉血小板数>毛细管血。

两种采血方法的优缺点比较 毛细血管血 静脉血 限制了重复实验和追 加实验，标本量少， 局部炎症可得假结果 ，组织液可混入 不同抗凝剂的使用， 改变血液性质，影响 有形成分的形态 缺点 标本代表性大，无组 织液影响，适于临床 研究，可重复实验和 追加其他实验 优点 价廉、快速、操作简 便，标本可直接测定

三）动脉采血法 1.器材准备：注射器、肝素生理盐水溶液、橡皮塞、消毒器材等。 2.选择动脉：多选用桡动脉、股动脉、肱动脉。 3.采血步骤 4.注意事项：①避免空气； ②立即送检；③防止血肿。

动脉采血法：血液气体分析 ( vacuum tube for blood collection) 部位：深部动脉如股动脉、桡动脉等。

三、血液标本抗凝

抗凝：应用物理的或化学的方法，除掉或抑制血液中的某些凝血因子的活性，阻止血液凝固，称抗凝。 抗凝剂（物质）：能够阻止血液凝固的化学试剂或物质。

1.枸橼酸钠（trisodium citrate） 又名柠檬酸钠；化学名：3-羟基-3-羧基戊二酸（三钠盐） a. 抗凝原理：螯合钙离子 使用方法 配成109 mmol/L的浓度和血液1：9 106 mmol/L的浓度和血液1：4 c. 适用范围：止血学检验、血沉、输血保养液（毒性小）

2.乙二胺四乙酸（EDTA）盐 a. 抗凝原理： 螯合钙离子 b. 使用方法： 15g/L浓度EDTA 和血液 1：10 适用范围： 对血细胞形态影响小---血小板计数； 影响血小板聚集和白细胞吞噬功能 ---不宜做止血学检验及血小板功能 检验。

3. 草酸盐（sodium oxalate） a. 抗凝原理：草酸钙沉淀 b. 使用方法 草酸钠0.1mol/L 和血液1：9 c. 适用范围： 止血学检验；逐步被淘汰。

4. 双草酸盐抗凝剂 a. 抗凝原理： 草酸钙沉淀 使用方法： 草酸钾0.8g , 草酸铵1.2g（100ml） 4. 双草酸盐抗凝剂 a. 抗凝原理： 草酸钙沉淀 使用方法： 草酸钾0.8g , 草酸铵1.2g（100ml） 与血液 1：10 （80°C以下烘干） 适用范围： 红细胞检验（红细胞比积、计数） 不适于血小板计数和白细胞分类计数

5. 肝素(heparin） 抗凝原理：加强抗凝血酶Ⅲ灭活丝氨酸蛋白酶，从而阻止凝血酶形成和抑制血小板聚集。 b. 适用方法： 1g/L浓度的肝素钠与血液 1：10

优点：抗凝能力强、不影响血细胞体积、不易溶血、能耐高温。 适用范围： 红细胞检验（红细胞计数、血红蛋白 测定、红细胞比积）和多种生化分析。但不适用于白细胞计数和分类计数。

6. 促凝剂 a. 抗凝原理：激活凝血蛋白酶，加速血液凝固。 b.适用项目：缩短血清分离时间，特别适用于急 诊化学检验。 常用促凝剂：凝血酶、蛇毒、硅石粉、硅碳素等。

7. 分离胶 抗凝原理：高粘度凝胶在血清和血块间形成隔层， 达到分离血细胞和血清的目的。 适用项目：能快速分离出清晰的血清标本， 有利于标本的冷藏保存。 注意事项：分离胶质量影响分离效果和检验结果；分离胶试管成本高。

物理方法抗凝 脱纤维蛋白： 将血液注入有玻璃珠的器皿中，转动，纤维蛋白缠绕凝固于玻璃球，从而防止血成凝块。适用于免疫学检验和红斑性狼疮细胞检查及血液培养基的羊血采集。也可用竹签搅拌除去纤维蛋白。

四、血涂片制备

1.血涂片的用途： 血细胞形态学检验、网织红、异常寄生虫检验。 2.载玻片要求：清洁、干燥、中性、无油腻 新购置载玻片处理：1mol/L HCl浸泡24h后再彻底清洗； 用过的载玻片：肥皂水煮沸20min，洗掉血膜再用清水清洗干净。

3.血涂片制备方法 （1）手工推片法 将推玻片向1的方向稍抽回，当血液快充满载片的宽度后，以一定均匀的速度向2的方向滑动。

良好血涂片标准：头、体、尾分明，厚薄适宜，边缘整齐，两侧留有空隙。 注意：涂片的厚薄与血滴的大小、推片与载片之间的角度、推片时的速度及血细胞比容有关。 血滴大，速度快、角度大----血膜厚 （）

（2）载（盖）玻片压拉法：用于血细胞的活体染色。 （3）棕黄层涂片法：离心取红细胞层上的棕黄层涂片。适用于白细胞减低患者的白细胞分类计数及红斑狼疮细胞检查。 （4）仪器自动涂片法 （）

五、血细胞常用的染色方法 常用染方法有:瑞氏染色法;瑞姬氏染色法； 姬姆萨氏染色法;

（一） 瑞氏染色法 1.染色原理 （1）染料组成：由酸性染料伊红（E）和碱性染料亚甲蓝（M）溶解于甲醇而成。 （2）瑞氏粉的性质：是一种复合染料 ME M+ + E- 甲醇

（3）甲醇的作用：溶解美蓝和伊红；固定细胞的形态；提高对染料的吸附作用。 （4）细胞对染液的反应 ：取决于其化学性质，既有物理的吸附，又有化学的亲和作用。 （5）pH对染色的影响：酸性环境中，涂片偏红；碱性环境中，涂片偏碱。 因此染色以pH6.4~6.8为宜。

2.试剂 （1）瑞氏染液：瑞氏粉1g，甲醇600mL，甘油15mL。 （2）磷酸盐缓冲液（PBS）：磷酸二氢钾（无水）0.3 g，磷酸氢二钠（无水）0.2g, 蒸馏水加到1000ml。 配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口备用。

3.染色方法 a. 用蜡笔在血膜两头划线，平放于染色架上。 b. 加瑞氏染液覆盖血膜，固定1min。 c. 滴加等量或稍多的缓冲液，混匀，染色5-10分钟。 d. 用清水冲洗，待干后镜检。

4.染色结果判断 1）正常：外观呈淡紫红色； 镜下红细胞染粉红色，白细胞胞质中颗粒清楚。 2）偏酸：涂片偏红， 核难着色 3）偏碱：染色偏蓝

5.瑞氏染液的质量评价 （1）采用吸光度比值（RA）为评价指标。瑞氏染液的成熟指数以RA（A650nm/A525nm）=1.3±0.1为宜. （2）染液的成熟过程主要是美蓝逐渐转变为天青B的过程。在密封条件下，贮存时间愈久，转化的天青B愈多，染色效果愈好。

6.注意事项 a. 血膜要干透后才能染色，否则染色时易脱落 b. 染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关， 一般染液淡、染色时间长些效果好。 c. 染液不能过少，以防蒸发沉淀。

d. 冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲，防染料沉着。冲洗时间也不能长。 e. 染色过淡，可复染。 f. 染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色。

（二）姬姆萨染色法 一）、染色原理： 基本成分仍然是伊红和亚甲蓝，改进了染料的质量，使细胞核和寄生虫着色好，结构显示更清晰，而胞浆和中性颗粒染色较差。 二）、试剂 Giemsa 甲醇 纯甘油 三）、染色方法 1. 甲醇固定干燥血膜3-5min 2. 将血膜在染液中浸染10-30min 3. 流水冲洗,待干后镜检

（三）方法学评价 1.瑞氏染色法是血细胞分析最常用的染色方法。尤其对于细胞质成分及中性颗粒等的染色效果较好，但对核的染色不如吉姆萨染液。 2.用瑞-吉姆萨复合染液可取长补短，获得满意效果。