酵母作为研究病原菌致病效应分子的工具 文献阅读：游明亮 2017/3/5

病原菌 病原菌（pathogenic bacteria）是指那些导致机体发病的细菌。是一群高度特化了的微生物，为了自身的生存，已适应而且必须在宿主生物体内持续存在或增殖，有时可造成宿主发病。

细菌致病性的确定 经典柯赫法则 第一，特殊的病原菌应在同一疾病中查见，在健康者不存在；第二，此病原菌能被分离培养而得到纯种；第三，此纯培养物接种易感动物，能导致同样病症；第四，自实验感染的动物体内能重新获得该病原菌的纯培养。

柯赫法则随在确定一种新的病原体时非常重要，但其有一定的局限性，某些情况并不符合该法则。如健康带菌或隐性感染，有些病原菌迄今仍无法在体外人工培养，有的则没有可用的易感动物。另外，该法则只强调了病原微生物一方面，忽略了它与宿主的相互作用，是不足之处。

基因水平的柯赫法则 第一，应在致病菌株中检出某些毒力或其产物，而无毒力菌株中则无；第二，如有毒力菌株的某个基因被损坏，则菌株的毒力应减弱或消除。或者将此基因克隆到无毒菌株内，后者成为有毒力菌株；第三，将细菌接种动物时，这个基因应在感染的过程中表达；第四，在接种动物检测到这个基因产物的抗体，或产生免疫保护。

细菌的致病性在很大程度上取决于其毒力因子，包括侵袭力与毒素，以及毒力因子的分泌系统。 细菌致病性的现代观点是将病原菌、宿主及二者的相互的作用综合考虑，纠正了只调节细菌本身的片面性，是认识的深化。 寻找一种模式生物来研究细菌致病性显得尤为重要

酵母 酵母（Yeast）是人类文明史中被应用得最早的微生物。 例如：用于制作面包和馒头等食品及酿酒。 酵母是属于简单的单细胞真菌，易于培养，且生长迅速，被广泛用于现代生物学研究中。如酿酒酵母作为重要的真核模式生物，是遗传学和分子生物学的重要研究材料。

酵母作为高等真核生物特别是人类基因组研究的模式生物，其最直接的作用体现在生物信息学领域。 1996年4月，公布测得酿酒酵母的完整基因组顺序，称为遗传学上的里程碑。 第一次获得真核生物基因组的完整核苷酸序列 第一次获得一种易于操作的实验生物系统的完整基因组 Liu Qing， 2000

优势 酵母是一种单细胞生物，能够在基本培养基上生长，使得实验者能够通过改变物理或化学环境完全控制其生长。 酵母在单倍体和二倍体的状态下均能生长，并能在实验条件下较为方便地控制单倍体和二倍体之间的相互转换，对其基因功能的研究十分有利。 酵母的生命周期很适合经典的遗传学分析，使得在酵母16条染色体上构建精细的遗传图谱成为可能。

可利用异源基因与酵母基因的功能互补以确证基因的功能。 在酵母中进行功能互补实验无疑是一种研究人类基因功能的捷径。如果一个功能未知的人类基因可以补偿酵母中某个具有已知功能的突变基因，则表明两者具有相似的功能。而对于一些功能已知的人类基因，进行功能互补实验也有重要意义。

相关实验技术 多克隆抑制—效应因子靶蛋白 酵母双杂交—相互作用蛋白 荧光标记技术—效应因子的亚细胞定位 DNA翻译图谱分析—宿主翻译水平的反应 全基因组文库—基因筛选、分离 细胞信号转导—研究效应因子具体功能

酵母为模式生物研究病原菌致病效应分子

多克隆抑制--Multi-copy suppression Helena Gaweska et al, 2004 用于筛选靶向的基因或者表达产物

酵母双杂交 酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。 --摘自生物谷

基于基因芯片的翻译图谱分析 利用基因芯片进行高通量的基因翻译图谱的分析，可以快速进行宿主对于病原菌效应因子的反应表达分析。 http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_microarray

荧光标记的亚细胞定位 亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位。如仅在核内存在，还是胞质内存在，还是细胞膜上存在。 FM4-64等是有效的研究分泌活动的选择性膜表面荧光标记物,它们在水相中没有荧光, 当它们插入脂质膜后则显示较强的荧光, 囊泡膜胞吐后会使细胞表面荧光增加 。 Xie Xiaoyan et al, 2004

Pathogenic genetic array（PGA） 系统性的构建双突变型来分析与宿主的基因的联系。 酵母中缺失某些基因的菌株能在有致病效应因子的培养基中生长，证明这些基因与效应因子发挥功能是有关系的。 但这个生长只是部分恢复，说明除了被敲除的基因外，效应因子还和其他基因有相互作用。

细胞信号转导 许多致病菌利用分泌系统将受体蛋白传递到宿主细胞中，调节宿主的信号传递途径，进而阻断或调节宿主免疫相关的信号通路 ，从而达到致病效果。 有些效应因子具有类似信号通路中激酶的作用，如GTP激活因子。

传统的药物筛选 基于体外的实验，通过小分子来抑制酶活性的方法来筛选靶向位点 ，没有考虑到药物进入细胞膜的通透性和靶向丢失效应 。 这种方法具有很强的特异性，能减少靶向缺失的问题。细菌效应因子的特异靶向还可以承受更少的选择压力，因为细菌的生长是不受影响的，这样可以减少对药物的抗性。

基于细胞的高通量的筛选方法

未来研究的方向 不是所有的效应因子都能在酵母中研究，因为他们的靶向过程在酵母中不是保守的。 单倍体缺失能同时于分析酵母中必需基因和非必需基因在效应因子作用后，其基因产物对酵母生长的影响。

文献的阅读思路 提供一个背景知识，可对研究病原体致病机制的研究提供技术参考。 列举了几个成功的实验方案，来说明酵母作为模式生物研究病原菌和宿主互作的良好应用前景。 除了进行基础研究外，在药物筛选等方面也可进行应用。

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