蛋白质化学 Protein Chemistry Fireflies: luciferin+ATP Erythrocytes: hemoglobin Hair, scales, horn: keratin

什么是蛋白质？ 蛋白质（Protein）是由多种不同的氨基酸，按照一定的顺序，通过肽键连接形成的一条或多条肽链组成的生物大分子。 蛋白质是生命活动的重要物质基础，没有蛋白质就没有生命。

形式及功能多样 蛋白质是最丰富的生物大分子，存在于所有的细胞及细胞的所有部分。一个简单的细胞中，蛋白质的差异极大、种类有成千上万种、分子量从小肽到数百万的巨大分子。蛋白质的生物功能还表现出极大的多样性，是生物信息最重要的终产物，是遗传信息表达的元件。 Protein一词来自希腊文“Protos”，指“first”或“foremost”，意即“头等重要”、“第一位的”、“最重要的”。

从地等的古细菌到复杂的生命体，蛋白质都是由相同的20种氨基酸共价连接而成的分子。细胞能够通过不同的组合和顺序，用20种氨基酸合成性质和功能截然不同的蛋白质，如酶、激素、抗体、运载体、肌肉、眼睛的晶状体蛋白质、羽毛、蜘蛛网、犀牛角、乳蛋白、抗生素、蘑菇毒素及各种不同生物活性物质。

18世纪中叶Beccari首次报道应用稀酸、稀碱可从动植物组织中分离到含氮类物质。1838年荷兰化学家Mulder将之应用于从动植物细胞中所发现的复杂的有机含氮化合物。 蛋白质结构复杂、种类繁多、功能各异,是生物体内构建生命、行使生命活动的最主要的功能分子,在几乎所有的生命活动中起着关键的作用。如果说基因是生命的指导者和构建生命的蓝图，那么蛋白质就是组成生命的主要材料,是生命的实践者和执行者。蛋白质将生物体的遗传信息表达成生物的性状,指导生命活动，控制生物的代谢、生长、发育及繁殖。

蛋白质化学研究史 I 1838年 Mulder研究了血清、蛋清、蚕丝等物质的元素组成后, 发现了组成生物体的复杂含氮物 19世纪末 从蛋白质水解产物分离得到了13种氨基酸, 基团学说消声匿迹 1902年 Fischer, Hofmeister同时提出肽键理论 1924年 Svedberg 发明超速离心机（100000 rpm, 700000 g） 1930年代 Bergmann合成出只含L型氨基酸的多肽 1950年 Pauling提出蛋白质的二级结构的基本单位：α-螺旋和β-折叠

蛋白质化学研究史 II 1953年 Sanger确定了牛胰岛素的一级结构 1958年 Perutz & Kendrew用X光衍射法确定了肌红蛋白的立体结构 1961年 Anfinsen证明蛋白质的一级结构决定其高级结构 1980年代 蛋白质工程的兴起 1994年 Williams和Wilkins首次提出Proteome (Protein + genome) 1997年 第一届国际蛋白质组学会议，蛋白质组学（Proteomics) 1999年 蛋白质芯片技术出现

蛋白质的经典分类法 I I. 按理化性质分: (英国Physiological Society, 1907) 1. 单纯蛋白 (simple protein) 1). Albumin (白/清蛋白） 溶于水、盐、酸、碱溶液, 加热凝固 (血清) 2). Globulin (球蛋白） 溶于盐、酸、碱溶液, 加热凝固 (血清) 3). Glutelin (谷蛋白） 溶于酸、碱溶液 (谷种) 4). Prolamine (醇溶谷蛋白）溶于70-90%酒精、酸、碱溶液 (谷种) 5). Scleroprotein (硬蛋白） 不溶 (毛、发、爪、皮肤) 6). Histone (组蛋白） 溶于水、酸溶液 (细胞核) 7). Protamine （鱼精蛋白） 溶于水、酸溶液 (精子) 2. 复合蛋白 (conjugated protein) 1). Nucleoprotein (核蛋白） 含戊糖或脱氧戊糖 (细胞核) 2). Phosphoprotein (磷蛋白）含有磷酸 (以酯的形式) (动物细胞、体液) 3). Lipoprotein (脂蛋白) 含脂质 (动植物细胞) 4). Chromoprotein (色蛋白） 含带Fe、Cu等的有机色素 (动植物细胞) 5). Glycoprotein (糖蛋白） 含糖及其衍生物 (动植物细胞)

蛋白质的经典分类法 II 3. 衍生蛋白质 (derived protein) i). Primary protein derivatives 天然蛋白质经少量变性后的产物 1). Gelatin (明胶） 胶原蛋白(collagen)加酸水解产物 2). Protean 水溶性蛋白质经水、酶、稀酸作用而不溶化 3). Metaprotein (变性蛋白质） 经稀酸、稀碱变性后的蛋白质 4). Coagulated protein (凝固蛋白质） 机械搅拌, 加酒精后形成的不溶物 ii). Secondary protein derivatives 进一步分解后的变性蛋白质 1). primary proteose (初期蛋白胅）溶于水, 加热不凝固, 易盐析 2). secondary proteose 溶于水, 加热不凝固, 难盐析 3). peptone (蛋白胨） 溶于水, 加热不凝固, 不能盐析 4). peptide 氨基酸的组成和序列一定的小分子

按功能的蛋白质分类法 1. 酶类, 占细胞内蛋白质种类的绝大部分 1. 酶类, 占细胞内蛋白质种类的绝大部分 2. 运输蛋白, 如albumin, hemoglobin, transferrin等 3. 收缩运动蛋白, 如actin, myosin, tubolin等 4. 激素蛋白, 如insulin, growth hormone等 5. 细胞激动素(cytokinin), 如EGF, PDGF, IL-2等 6. 受体蛋白, 如insulin receptor, rhodopsin等 7. 毒素蛋白, 如cholera toxin, ricin, pertussis等 8. 营养贮藏蛋白, 如prolamine, glutelin等 9. 防御蛋白, 如IgG等 10.结构蛋白, 如keratin, collagen等

对蛋白质化学有突出贡献的Nobel奖获得者 1902年 H.E.Fischer (德，化) 肽键理论，多肽合成 1910年 A.Kossel (德，医) 组氨酸、组蛋白的发现，碱基的发现 1915年 W.H.Bragg/W.L.Bragg (德，物） 用X射线测定晶体物质结构 1926年 T.Svedberg (瑞，化) 用超离心手段决定蛋白质的分子量 1946年 J.B.Summer (美，化) 蛋白质酶的结晶，证明酶的本质为蛋白质 1948年 A.W.K.Tiselius (瑞，化) 电泳装置的开发，血清蛋白的研究 1952年 A.J.P.Martin/R.L.M.Synge (英，化〕分配层析发明，氨基酸的分离 1954年 L.Pauling (美，化) 蛋白质二级结构，抗原抗体反应理论 1958年 F.Sanger (英，化) 胰岛素一级结构的测定 1962年 M.F.Perutz/J.C.Kendrew (英，化) X射线确定蛋白质的立体结构 1972年 G.M.Edelman/R.R.Porter (美，医〕抗体的化学构造与功能的解明 1972年 W.H.Stein/S.More (美，化) RNase的一级结构和活性中心的解明 1972年 C.B.Anfinsen (美，化) 蛋白质的一级结构决定其立体结构 1998年 S.B.Prusiner (美，医) Prion:蛋白立体结构的变化导致疾病

蛋白质的化学组成 元素组成 氢(H) 6%-7% 氧(O) 19%-24% 氮(N) 13%-19% 硫(S) 0%-4% 碳(C) 50%-55% 元素组成 氢(H) 6%-7% 氧(O) 19%-24% 氮(N) 13%-19% N：平均16% 硫(S) 0%-4% 各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16%。由于体内组织的主要含氮物是蛋白质，因此，只要测定生物样品中的氮含量，就可以按下式推算出蛋白质大致含量。 每克样品中含氮克数×6.25×100=100克样品中蛋白质含量(克%) 有些含P、I，少量的还含有Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo等

蛋白质系数 不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种不同的蛋白质其含氮量也不同，一般蛋白质含氮量为16%，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。蛋白质含量=N含量6.25. 不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。

氨基酸是蛋白质的基本组成材料 蛋白质用强酸、强碱处理后，可以得到各种各样的氨基酸。在动植物组织中可以分离得到26-30种不同的氨基酸。第一个氨基酸早在两个世纪前就已经被发现，而最后一个氨基酸在1935年才发现。直到1965年才搞清楚，只有20种氨基酸才是生命体中合成蛋白质的原材料（称为一级氨基酸, Primary amino acid）。 # 最近又多了两种一级氨基酸

20种氨基酸的发现年代表 天冬酰氨 1806 Robiquet &Vauquelin 天门冬属植物液 甘氨酸 1820 Braconnot 明胶水解物 亮氨酸 1820 Braconnot 羊毛、肌肉 酪氨酸 1849 Bopp 奶酪 丝氨酸 1865 Cramer 蚕丝 谷氨酸 1866 Ritthausen 面筋 天冬氨酸 1868 Ritthausen 蚕豆 苯丙氨酸 1881 Schultze 羽扇豆芽 丙氨酸 1881 Weyl 丝心蛋白 赖氨酸 1889 Drechsel 珊瑚 精氨酸 1895 Hedin 牛角 组氨酸 1896 Kossel, Hedin 奶酪 胱氨酸 1899 Morner 牛角 缬氨酸 1901 Fischer 奶酪 脯氨酸 1901 Fischer 奶酪 色氨酸 1901 Hopkins 奶酪 异亮氨酸 1904 Erhlich 纤维蛋白 甲硫氨酸 1922 Mueller 奶酪 苏氨酸 1935 McCoy et al 奶酪 20种氨基酸的发现年代表

氨基酸的名称及三字、单字符号 不用的字母 JUZBOX 要求： 能熟背 Alanine 丙氨酸 Ala A Arginine 精氨酸 Arg R Asparagine 天冬酰氨 Asn/Asx N Aspartic acid 天冬氨酸 Asp/Asx D Cysteine 半胱氨酸 Cys C Glutamine 谷氨酰胺 Gln/Glx Q Glutamic acid 谷氨酸 Glu/Glx E Glycine 甘氨酸 Gly G Histidine 组氨酸 His H Isoleucine 异亮氨酸 Ile I Leucine 亮氨酸 Leu L Lysine 赖氨酸 Lys K Methionine 甲硫氨酸 Met M Phenylalanine 苯丙氨酸 Phe F Proline 脯氨酸 Pro P Serine 丝氨酸 Ser S Threonine 苏氨酸 Thr T Tryptophan 色氨酸 Trp W Tyrosine 酪氨酸 Tyr Y Valine 缬氨酸 Val V 不用的字母 JUZBOX 要求： 能熟背

一级氨基酸的结构及旋光性

L-氨基酸的基本结构 COOH H2N C H R 二十种氨基酸除Gly外全是L-型。 Pro呢？ Chiral carbon α碳原子,不对称碳原子 侧链 Chiral carbon 残基：肽链中，氨基酸之间缩合时都脱去一个水分子，脱水后的残余部分叫残基（residue), 因此蛋白质肽链中的氨基酸统统是残基形式。

氨基酸可以通过R基团分类 标准氨基酸的化学特性对于理解它们的生物化学是关键的，依据侧链R基团的特性，可以将氨基酸分成5类以简单化，特别是在生理pH条件下（pH 7.0附近），它们的极性或与水发生作用的趋势。氨基酸侧链的极性差异极大，从完全非极性或疏水性（水不溶性）到高极性或亲水性（水溶性）。

二十种一级氨基酸的结构 

非极性（脂肪族）R侧链，Ala、Val、Leu及Ile的侧链在蛋白质分子中易于聚拢在一起，通过疏水作用稳定蛋白质的结构。Gly是最简单的氨基酸，虽然疏水，但最小的侧链对于疏水作用没有贡献。Met的侧链有硫酯基团。 ——分支氨基酸

芳香族氨基酸，具有芳香环侧链，相对非极性，都能参与疏水作用，Tyr的羟基能够形成氢键，是一些酶的重要的功能基团。Tyr和Trp比Phe是明显更加极性的氨基酸（羟基及吲哚环上的N）。

芳香氨基酸的紫外吸收曲线 比较pH 6.0时Trp和Tyr的紫外吸收光谱，相同条件下，等摩尔数（10-3 M）的Trp的光吸收是Tyr的4倍，两者最大光吸收的波长在280 nm附近。第三个紫外光吸收的氨基酸-Phe，对蛋白质光吸收的贡献很小（未显示）。

极性不带电的R基团，与非极性氨基酸相比，这些氨基酸的R基团在水中溶解度较大或更加亲水，它们的侧链基团可以与水形成氢键。Asn和Gln是蛋白质中的两个酰胺氨基酸，易于被酸或碱水解。Cys的巯基易氧化形成二硫键，对蛋白质高级结构的形成重要。 

植物常受到逆境条件的危害，其中由干旱和盐渍引起的渗透胁迫对植物的生长和产量影响最大。但植物通过长期的进化已形成了许多机制抵抗外界的逆境条件。在渗透胁迫下，植物可通过积累一定量的溶质降低水势，维持植物体内的水分平衡，保证植物的正常生长。这类物质包括一系列的含氮化合物(如脯氨酸、多胺等)，分布最广的是脯氨酸(Pro)。Pro主要以游离状态广泛存在于植物中，它是水溶性最大的氨基酸（50 mg/ml），具有较强的水合能力。在植物细胞生理干旱时，它的增加有助于细胞或组织持水。植物中游离脯氨酸含量(干重)甚微(0.2-0.69 mg/g)，约占游离氨基酸总量的百分之几，但受到干旱、盐渍等渗透胁迫时，脯氨酸会大量积累，其含量甚至高达百倍以上。所有的植物在盐渍条件下会发生游离Pro的积累。如以杆裂丝藻为材料的研究发现，当培养基盐度从0提高到40%时，Pro以外的其余15种氨基酸总量从95 mM上升到120 mM，而Pro则由2 mM增加到278 mM。

常见氨基酸的溶解度

半胱氨酸Cysteine和胱氨酸Cystine 二硫键 Disulfide bond

带正电荷的三个碱性氨基酸，最为亲水的R基团，pH 7 带正电荷的三个碱性氨基酸，最为亲水的R基团，pH 7.0时带正电荷，侧链上有第二个氨基，Arg有带正电的胍基，His有可带电的咪唑基（唯一），在许多酶促反应中作用质子供体/受体。

亲水指数

L型和D型的由来 甘油醛的旋光性 左旋甘油醛的构型 右旋甘油醛的构型 按原子序数法确定了L型和D型氨基酸，但现在L和D已经不代表氨基酸的旋光性，只代表氨基酸的绝对构型。 为什么？

现在为了正确表示左旋和右旋，采用（＋）和（－）的符号，（＋）代表右旋，（－）代表左旋。从右旋的D型甘油醛出发，可以合成出左旋的D型乳酸。从这点我们也可以看出物质的旋光性与手性原子上的构型没有确定的关系。 左旋D型乳酸 右旋D型甘油醛

L型氨基酸 与 D型氨基酸 L- amino acid D- amino acid

旋光性I

旋光性II

“黄氏”判断法 （看CAR的走向） A C C R L型 D型 A R 将H原子靠近自己，观察CAR的走向，逆时针（左转）为L型，顺时针（右转）为D型。 D：dextro (右) C：carboxyl group L： levo (左) A：amino group R：residue 拉丁语中 A C C R L型 D型 A R

苏氨酸 Thr 有四种异构体 L-别苏氨酸

其他氨基酸的结构

出现在蛋白质上的氨基酸修饰 4-Hydroxyproline 在胶原蛋白上 5-Hydroxylysine, 6-N-methyllysine, desmosine 在结缔组织中 Phospho-Ser, -Thr, -Tyr 信号转导蛋白 γ-Carboxyglutamic acid 凝血酶中 Pyroglutamic acid 神经肽的N端 均为氨基酸参入肽链后经修饰而来

蛋白质中的氨基酸修饰-羟基化 从各种生物分离到的氨基酸已达250种以上 大量出现在胶原蛋白 4-羟脯氨酸 结缔组织 5-羟赖氨酸

蛋白质中的氨基酸修饰-甲基化 锁链素，吡啶环由4个Lys分子的侧链组成，存在于弹性蛋白（elastin）中 结缔组织

蛋白质上的氨基酸修饰 凝血酶 信号传导 γ-羧基谷氨酸 O-磷酸丝氨酸

Pyroglutamic acid (焦谷氨酸), 游离型氨基酸衍生物 Pyroglutamic acid (焦谷氨酸), 神经肽的N端多数为焦谷氨酸 能够增加细胞合成乙酰胆碱、增加乙酰胆碱受体的数量、加强大脑左右半球之间的信息交流，帮助提高记忆力和头脑敏锐度。

游离型氨基酸衍生物 21号和22号primary amino acid ？？？ Ornithine（鸟氨酸）; Citrulline（瓜氨酸） 5’-Hydroxytryptophan（5-羟色胺） Homoamino acids（同型氨基酸） 3,4-Dihydroxyphenylalanine (DOPA)（多巴） γ-Aminobutyric acid (GABA) Mono, di, tri-iodotyrosine; thyroxine β - Alanine,……etc

SeC（selenocysteine，硒半胱氨酸） 第21个一级氨基酸? 遗传密码字典的破译，通用性作为遗传密码的基本特点之一被人们认可。近年来研究发现了一些例外，除线粒体使用一组密码子其含义有别于核基因之外，原先被认为仅用作终止信号的无义密码子在某些情况下可重新诠释，编码特定的氨基酸。硒代半胱氨酸就是由UGA无义编码。 第21个基本氨基酸的密码（E.coli）：硒代半胱氨酸 密码子为UGA，有特殊的 tRNA-Ser与其识别，Ser结合入肽链，则立即修饰为硒代半胱氨酸

PyL (Pyrrolysine，吡咯赖氨酸) - 第22个一级氨基酸? 是目前已知的第22种参与蛋白质生物合成的氨基酸,与标准氨基酸不同的是，由终止密码子UAG的有义编码形成。与之对应的在产甲烷菌中也含有特异的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)和吡咯赖氨酸tRNA (tRNAPyl)，tRNAPyl具有不同于经典tRNA的特殊结构。 Hao, B., et al. A novel UAG encoded residue in the structure of a methanogen methyltransferase. Science 296: 1462-1466, 2002.

游离型氨基酸衍生物-参与尿素循环 鸟氨酸 (存在于尿素循环，与氨甲酰磷酸合成瓜氨酸) 瓜氨酸(存在于尿素循环,从西瓜汁分离到)，与Asp作用生成精胺琥珀酸，再转变为Arg而裂解生成尿素

游离型氨基酸衍生物-5-羟色胺 5-hydroxytryptamine （5-HT, 5-羟色胺 ） “The taste of love” 是松果体素 ( 褪黑素, melatonin，5-甲氧基-N-乙酰色胺 ) 和 血清素(serotonin) 的前体。 5-HT作为神经递质，主要分布于松果体和下丘脑，可能参与痛觉、睡眠和体温等生理功能的调节。 HO

游离型氨基酸衍生物-同型氨基酸 比通常的氨基酸多一个甲基，如： Homoserine 微生物、植物的代谢中间产物 Homocysteine Homocitrulline 摄取高Lys含量的食物时从尿中排出 Homomethionine* Met的分解产物，存在于S-adenosylhomo-cysteine和叶酸中. Homocysteine Methionine

游离型氨基酸衍生物-酪氨酸代谢物 DOPA,多巴 儿茶酚乙胺 Dopamine, 多巴胺 tyrosine Epinephrine, 肾上腺素 tyrosine norepinephrine 去甲肾上腺素 3,4-dihydroxyphenylalanine DOPA,多巴 3,4-dihydroxyphenylethylalanine Dopamine, 多巴胺 从Tyr衍生出来的重要生理物质， 其中多巴是一种氨基酸。 S-adenosylmethionine S-adenosylhomocysteine 儿茶酚乙胺

游离型氨基酸衍生物-谷氨酸衍生物 味精是神经递质GABA的直接前体 glutarmic acid GABA, γ-aminobutyric acid carnitine, 肉毒碱（可用来减肥） 味精是神经递质GABA的直接前体 S-adenosylmethionine S-adenosylhomocysteine 过量促进食欲, 促肥胖

游离型氨基酸衍生物-甲状腺素 甲状腺内贮存碘的氨基酸 tyrosine triiodotyrosine tetraiiodotyrosine (thyroxine) tyrosine diiodotyrosine monoiodotyrosine 甲状腺内贮存碘的氨基酸 triiodotyrosine

氨基酸的理化性质

氨基酸的理化性质 一般物理性质 无色晶体，熔点较高（200～300℃） ，水中溶解度各不同，取决于侧链。 氨基酸的理化性质 一般物理性质 无色晶体，熔点较高（200～300℃） ，水中溶解度各不同，取决于侧链。 在紫外有特征吸收的仅三个芳香族的氨基酸Trp、Tyr、Phe, 利用这一特点，可以通过测定280 nm处的紫外吸收值的方法对蛋白质溶液进行定量。

氨基酸的光吸收 构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。 在近紫外区(220-300nm)只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有吸收光的能力。可以通过测定280 nm 处的紫外吸收值的方法对蛋白溶液进行定量。 苯丙氨酸的max＝257 nm，257=2.0x102 酪氨酸的max＝275 nm，275=1.4x103 色氨酸的max＝280 nm，280=5.6x103

Spectroscopy of amino acids Only the aromatic amino acids absorb light in the UV region Spectroscopy of amino acids

紫外光吸收的测定装置 Lambert-Beer law: A=log Io/I=cl A: absorbance Io: intensity of the incident light I: intensity of the transmitted light : molar extinction coefficient（摩尔消光系数） ( parallel and monochromatic )

氨基酸的理化性质-两性电解质 同一个氨基酸分子上可以同时解离携带正电荷和负电荷，被称为两性电解质（ampholyte）。 在水溶液中，氨基和羧基在不同的pH条件下表现出不同的解离状态；当氨基酸分子上的电荷总量为零时（净电荷为零），该溶液的pH称为等电点（isoelectric point)，以符号pI 来表示。

氨基酸的两性离子 两性离子也称两极离子（dipolar ion） 两性电解质（ampholyte）

等电点 (isoelectric point, pI) 氨基酸、多肽等两（兼）性电解质[ampholyte]在溶液中所携带的净电荷 [net electric charge]为零时的溶液的pH值。因此也叫isoelectric pH.

比较常见的错误 氨基酸溶液的净电荷为零； 物质所带净电荷为零时溶液的pH值； 氨基酸的净电荷为零时的pH值；

解离基团的pK值会发生较大的变化

蛋白质的等电点计算 只是参考值，因为许多基团的 pK受微环境的影响而发生较大变化

1 mol Gly溶于水时，溶液的pH约为6，用标准NaOH进行滴定的滴定曲线。 氨基酸的酸碱滴定曲线 1 mol Gly溶于水时，溶液的pH约为6，用标准NaOH进行滴定的滴定曲线。

More Titration Curves

氨基酸等电点及解离百分数的计算 公式：pH=pK+lg([质子受体]/[质子供体])，可定量计算氨基酸在某一pH条件下的解离百分数。氨基酸等电点pI值是由兼性离子两侧基团的pK值所决定的。 eg: Gly K1=[+H3NCH2COO-] [H+]/ [+H3NCH2COOH] K2=[H2NCH2COO-] [H+]/ [+H3NCH2COO－] pH=pI时， +H3NCH2COOH＝ H2NCH2COO－ K1K2 = [H+]2 2pH= pK1 + pK2 pH=( pK1 + pK2) / 2 pI= ( pK1 + pK2) / 2 同理对含三个可解离基团的氨基酸来说，只要写出它的电离式，然后取兼性离子两边的pK值的平均值，即得其pI值。

pH<pI,带正电；pH=pI,不带净电；pH>pI,带负电。 氨基酸等电点的计算 侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值： pI = (pK1 + pK2 )/2 pH<pI,带正电；pH=pI,不带净电；pH>pI,带负电。

同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。 酸性氨基酸： pI = (pK1 + pKR-COO- )/2

碱性氨基酸： pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2 二十种基本氨基酸，除His外，在生理pH（pH7左右）下都没有明显的缓冲容量，因为这些氨基酸的表观解离常数都不在pH7附近，缓冲容量只有在接近表观解离常数值时才表现出来。His咪唑基的解离常数为6.0，在pH7附近有明显的缓冲作用。血红蛋白含有较多的His残基，在pH7左右的血液中具有明显的缓冲能力，对运输氧和二氧化碳重要。

氨基酸的主要化学反应

氨基酸的化学性质（I） ●850℃左右分解成 ？ ●氨基的化学反应: ◆与茚三酮 (ninhydrin) 的反应 定量反应 ●850℃左右分解成 ？ ●氨基的化学反应: ◆与茚三酮 (ninhydrin) 的反应 定量反应 ◆与亚硝酸的反应 Van Slyke定氮 ◆与2,4-二硝基氟苯 (FDNB) 的反应 测序 ◆与甲醛的反应 氨基滴定 ◆与酰化基的反应 氨基保护基 ◆与二甲基氨基萘磺酰氯 (DNS-Cl)的反应 测序 ◆与荧光胺的反应 微量检测 ■与Edman试剂 (苯异硫氰酸) 和 测序 有色Edman试剂的反应

-氨基参与的反应 -与亚硝酸反应(Van Slyke定氮) 用途：范斯来克法定量测定氨基酸的基本反应，标准条件下测定生成氮气的体积，可计算氨基酸的量，用于氨基酸定量和蛋白质水解程度的测定。 注意：生成的N2只有一半来自氨基酸、侧链氨基？？

-氨基参与的反应 与甲醛发生羟甲基化反应 羟甲基氨基酸 二羟甲基氨基酸 用途：可以用来直接测定氨基酸的浓度。

-氨基参与的反应 -烃基化反应（DNFB法） 二硝基氟苯（DNFB）法（桑格反应，Sanger reaction） pH 8-9 用途：是鉴定多肽N-端氨基酸的重要方法

-氨基参与的反应 -烃基化反应(Sanger法) Sanger法N端测序。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。 用途：是鉴定多肽N-端氨基酸的重要方法

-氨基参与的反应 -烃基化反应(PITC法） Edman氨基酸顺序分析法（苯异硫氰酸酯PITC法），实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。 用途：是鉴定多肽N-端aa和aa顺序的重要方法

-氨基参与的反应 -酰基化反应(丹磺酰氯法） 用途：是鉴定多肽N-端氨基酸的重要方法。

在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯DNS-Cl）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸(DNS-AA)。 此方法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9 mol。

-氨基参与的反应 -酰基化反应（氨基保护反应） ＋ HX 用途：用于保护氨基以及肽链的合成。

-氨基参与的反应 -生成西佛碱 用途：是多种酶促反应的中间过程。

-氨基参与的反应 -脱氨基反应 用途：酶催化的反应。

氨基酸的化学性质（II） ●羧基的化学反应 ▲Strecker降解: 弱氧化剂 (次氯酸钠, N-bromosuccin imide) 作用下生成NH3和醛(RCHO) ▲特殊条件下, 还原成氨基醇、氨基醛 ▲与肼 (hydrazine) 的反应 C端氨基酸分析 ●侧链的化学反应 ▲羟基: 酯化 (生物体内的磷酸化) ▲巯基: 氧化还原

-羧基参与的反应 -成盐成酯反应 a. AA + NaOH －→ 氨基酸钠盐(氨基酸的碱金属盐能溶于水，重金属盐不溶于水) b. HCl 　AA + EtOH －→ 氨基酸乙酯的盐酸盐 当AA的-COOH变成甲酯、乙酯或钠盐后，-COOH的化学反应性能被掩蔽或者说COOH被保护，-NH2的化学性能得到了加强或活化，易与酰基结合。 为什么AA的酰基化和烃基化在碱性溶液中进行？

-羧基参与的反应 -形成酰卤的反应

用途：常作为多肽合成活性中间体，活化羧基。 -羧基参与的反应 -叠氮化反应 用途：常作为多肽合成活性中间体，活化羧基。

-羧基参与的反应 -脱羧（基）反应 用途：脱羧酶催化的反应

氨基酸的化学性质（III） 根据氨基酸侧链的结构，历史上曾研究出了每种氨基酸侧链的特异性反应，可以用来定性和定量分析，但现在已经基本弃用。

-氨基和羧基共同参与的反应 -与茚三酮反应（氨基酸定性、定量分析） 水合茚三酮 还原茚三酮 紫色产物 Pro、Hypro ??

-氨基和-羧基共同参与的反应 -成肽反应 用途：是多肽和蛋白质合成的基本反应

巯基（-SH）的反应 -侧链基团的反应（与重金属反应） 作用：与金属离子的螯合性质可用于体内解毒

作用：氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键形成或断裂。 巯基（-SH）的反应 -侧链基团的反应 巯基的氧化及二硫键的还原 作用：氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键形成或断裂。

作用：氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键断裂。二硫苏糖醇(DTT)也可以用来打开胱氨酸上的二硫键。 巯基（-SH）的反应 -侧链基团的反应 + 6HCOOH 6HCOOOH DTT 作用：氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键断裂。二硫苏糖醇(DTT)也可以用来打开胱氨酸上的二硫键。

巯基（-SH）的反应 -侧链基团的反应（与碘乙酸反应）

羟基的反应 -侧链基团的化学性质 二异丙基氟磷酸酯, DFP、DIPF、DIFP +HF 作用：可用于修饰蛋白质。

氨基酸的应用

氨基酸的应用-医药工业 氨基酸输液 必需氨基酸：甲硫氨酸、色氨酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸 (假设来写一两本书） 半必需氨基酸：精氨酸、组氨酸是幼儿所必需的。

Hb形成所必需、调节糖和能量水平、修复肌肉组织、加快愈合、防治肝衰竭 Thr 协助蛋白质吸收利用、防止肝中脂肪积累、促进抗体生成增强免疫 必需氨基酸 作 用 Leu 促进睡眠、减缓疼痛、缓解酒精中毒 Lys 减低感染、提高注意力、帮助脂肪酸分解 Phe 降低饥饿感、改善记忆、消除抑郁 Ile/Val Hb形成所必需、调节糖和能量水平、修复肌肉组织、加快愈合、防治肝衰竭 Thr 协助蛋白质吸收利用、防止肝中脂肪积累、促进抗体生成增强免疫 Met 帮助分解脂肪、可预防脂肪肝/心血管及肾脏疾病、消除重金属及抗氧化 Trp 减轻焦燥不安、促进睡眠、控制酒精中毒

氨基酸的应用-治疗药剂 Arg：对治疗高氨血症、肝机能障碍等疾病颇有效果； Asp：钾、镁盐可用于恢复疲劳；治疗低钾症心脏病、肝病、糖尿病等。 Cys：能促进毛发的生长，可用于治疗秃发症；甲酯盐酸盐可用于治疗支气管炎等； His：可扩张血管，降低血压，用于心绞痛，心功能不全等疾病的治疗。

氨基酸的应用-食品工业 营养强化剂； 谷氨酸单钠盐—味精； 天冬氨酸钠：可用于清凉饮料，能增加清凉感并使香味浓厚爽口； 天冬氨酰苯丙氨酸甲酯：甜味素（APM）

氨基酸的应用-农业 杀虫剂：刀豆氨酸、5-羟色氨酸可使南方毛虫拒食而死；半胱氨酸可杀死黄瓜蝇；甘氨酸乙酯衍生的二硫代磷酸盐具有较强的杀蚜虫和杀螨效果； 杀菌剂：N-月桂酰缬氨酸可用作治疗稻瘟病；-1，4环己二烯丙氨酸能抑制黑穗病毒、稻瘟病等； 除草剂：如N-3,4-二氮丙氨酸，硫代氨基酸酯等。

氨基酸的应用-化妆品 氨基酸能调节皮肤pH的变化，对细菌有抑制作用，也可作为皮肤、毛发的营养成分，增加皮肤、毛发的光泽。 防止皮肤干燥的自然保湿因子的主要成分是甘氨酸、羟基丁氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸等游离氨基酸。 在化妆品中添加天冬氨酸或其衍生物以及一些维生素，可防止皮肤老化。

氨基酸的应用-化学工业 维生素B6:可采用丙氨酸或天冬氨酸为原料合成。 叶酸：需要用谷氨酸为原料合成。 氨基酸表面活性剂：酰基谷氨酸钠、十六烷基-L-赖氨酰-L-赖氨酸甲酯二盐酸、月桂酰-L-精氨酸乙酯盐酸等具有较强的抗菌杀菌活性，且无刺激性。 聚合氨基酸：聚谷氨酸甲酯可用于作为合成皮革的表面处理剂；聚天冬氨酸或聚谷氨酸的二烷基酯与磷酸高级烷基酯结合得到的化合物可作为可塑剂，稳定剂等。

氨基酸的鉴定、分离纯化

氨基酸的鉴定 凡是具有游离氨基的氨基酸（α-氨基酸）能与茚三酮试剂反应，生成紫色化合物。这种反应非常灵敏，是鉴定α-氨基酸（除脯氨酸外）的最简便、最迅速的方法，可用于-氨基酸的比色测定和纸上层析的显色。 茚三酮试剂：0.2%的茚三酮酒精（95%酒精）溶液。

氨基酸的分离分析 分配柱层析：支持剂是一些具有亲水性的不溶性物质，如纤维素、淀粉、硅胶等。 滤纸层析（分配层析） 薄层层析（吸附层析、分配层析） 离子交换层析：阴离子交换树脂-N(CH3)3OH，阳离子交换树脂-SO3H 电泳（纸电泳）

分配层析的一般原理 1941年Martin与Synge（英）提出分配层析。所有的层析系统都有两个相组成，一个为固定相或静相(stationary phase)，一个为流动相或动相(mobile phase)，混合物在层析系统中的分离决定于混合物在两相中的分配情况。 分配定律：当一种溶质在两种一定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定的温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数。即分配系数(partition or distribution coefficient)（kd）。 　 Kd ＝ CA/ CB 　　 (1891, Nernst) CA ：在A相（动相）中的浓度 CB ：在B相（静相）中的浓度 物质分配：液－液 固－液 气－液 ，层析系统的静相可以是固相、液相或固液混合相，动相可以是液相或气相，它们充满于静相的空隙中并能流过静相。

有效分配系数： Keff=某一物质在A相中的总量/某一物质在B相中的总量 对液—液层析系统： Keff=CA×VA/ CB× VB = Kd× Rv VA：A相的体积　　VB：B相的体积 　 RV＝A、B两相的体积比 Keff是RV的函数，溶质的有效分配系数可以调查两相的体积比而加以改变。 分离的先决条件：各种AA成分的分配系数有差异，差异越大，越容易分开。

分配层析的原理：逆流分配 (Countercurrent distribution) A：上相，流动相 B：下相，静相 VA=VB Y的Kd=1，Z的Kd=3 平衡后，将上相转移到第二管内，其中含有相同体积的新下相。

eluent eluate

滤纸层析 (Filter-paper chromatography) 分配层析的一种，滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层(development)用的溶剂是流动相，层析是混合氨基酸在两相中不断被分配，使它们分配在滤纸的不同位置。 滤纸层析是分离及简单氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质氨基酸成分的定性鉴定及定量测定。 还可以通过双向层析，利用不同的展层剂系统使在两向系统中不同Rf值的氨基酸分开(two- dimensional paper chromatography)。

纸层析、薄层层析

离子交换柱层析法 (Ion-exchange column chromatography) 此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的AA进行分离的方法。 离子交换树脂可以分为阳离子交换树脂（如羧甲基纤维素等）和阴离子交换树脂（如二乙基氨基乙基纤维素等）。 带正电荷多的AA与树脂结合较强，而带正电荷少的AA与树脂结合则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，通过Na+的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的AA进行分离。也可以用不同pH值的缓冲液洗脱。

树脂resin（据所含交换基团的性质分） 阳离子交换树脂 强酸型 含磺酸基团 (R-SO3H) 中等酸型 含磷酸基团 (-O-PO2H4) 弱酸型 含酚基、羧基 阴离子交换树脂 强碱 含季胺基团 [-N+(CH3)3] 弱碱 含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2 阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。

离子交换纤维素 阴离子交换纤维素 —如:DEAE-纤维素，pH8.6以下分离中性或酸性物质，具二乙胺乙基。 阳离子交换纤维素—如:CM-纤维素，一般pH>4条件下使用,具有羧甲基。

离子交换凝胶 — 分离大分子物质 如：葡聚糖（Sephadex）、 聚丙烯酰胺（PAG）、琼脂糖（Sepharose）

离子交换层析法

离子交换层析

气相色谱 (Gas liquid chromatography，GLC) 当层析系统的流动相为气体，固定相为涂渍在固体表面的液体时，这类层析技术被称为气-液色谱或气相色谱。原理也是分配过程，利用样品组分在流动的气相和固定在颗粒表面的液相是分配系数不同以达到分离组分的目的。涂有薄层液体的惰性颗粒被装在一根长度不锈钢管或玻璃管中（色谱柱），在适当温度下，令高压气体连续通过色谱柱，待分离样品在进样室被气化后流经固定相，气化的样品在流动的气相和固定相的液相之间发生分配，将组分分离开来。

Gas Chromatography gas system inlet column detector data system Filters/Traps Air Hydrogen Gas Carrier Column Data system Syringe/Sampler Inlets Detectors Regulators H RESET gas system inlet column detector data system

氨基酸由于含有各种极性基团，气化十分困难，必须将它们转变为容易挥发的衍生物才能进行气相色谱。氨基酸与PITC反应生成PTH-氨基酸，再经三甲基硅烷基化(trimethylsilylation)，可得到很好气化的氨基酸衍生物。

PTH-AA

高效液相色谱 (High performance liquid chromatography, HPLC) 曾称高压液相色谱，以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。快速、灵敏、高效的分离和分析技术。 固相支持物的颗粒很细，表面积很大；溶剂系统采取高压，洗脱速度快。多种类型的柱层析都可以用HPLC代替，如分配层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤等。

参考书籍： GC Barrett: Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids. Chapman & Hall, 1985. Greenstein & Winitz: Chemistry of the Amino Acids. John Wiley & Sons Inc, 1961. Cohen: Science 267, 1265-1266. CR Cantor & PR Schimmel: Biophysical Chemistry, pt I, Freesman, 1980 DL Nelson & MM Cox: Lehninger Principles of Biochemistry (4th edition)