实验二、补骨脂黄酮体的提取、分离及鉴定 廖矛川 王德彬 刘新桥 王 强 帅 丽 胡 昀 天然药物化学实验 中南民族大学药学院

实验目的和要求 掌握补骨脂黄酮体的提取分离原理及操作： 溶剂法提取、聚酰胺柱色谱分离 熟悉黄酮类化合物在聚酰胺上的吸附规律与结构的相互关系。

不同层析系统原理 硅胶：是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，硅胶为极性吸附剂，化合物的极性越强，吸附剂对其吸附能力就越强；洗脱剂的极性越大，其洗脱能力就越强。 聚酰胺：由酰胺键聚合形成的高分子化合物。当所分离化合物的结构与聚酰胺形成氢键的能力越强，其吸附越强，越难洗脱。其用途比较广，基本上各种类型化合物都能使用。

聚酰胺具有“双重色谱”性能之故，即其分子中既有非极性的脂肪链，又有极性的酰胺基团，当用极性移动相（如含水溶剂系统）洗脱时，聚酰胺作为非极性固定相，其色谱行为类似反相分配色谱，因黄酮苷比游离黄酮极性大，所以苷比游离黄酮容易洗脱。当用有机溶剂（如氯仿-甲醇）洗脱时，聚酰胺作为极性固定相，其色谱行为类似正相分配色谱，因游离黄酮的极性比黄酮苷小，所以游离黄酮比黄酮苷容易洗脱。

聚酰胺“双重色谱”原理 正相色谱 反相色谱 聚酰胺：极性固定相（极性酰胺基团） 非极性固定相（非极性脂肪链） 苷与苷元聚酰胺色谱 聚酰胺“双重色谱”原理 正相色谱 反相色谱 聚酰胺：极性固定相（极性酰胺基团） 非极性固定相（非极性脂肪链） 洗脱剂：有机溶剂（氯仿-甲醇，极性小） 含水溶剂（甲醇-水，极性大） 先洗脱：游离黄酮（苷元，极性小） 苷（极性大）（柱色谱分离） Rf值： 苷元 > 苷 苷元 < 苷（TLC色谱鉴别） ***上述规律也适用于黄酮类化合物在聚酰胺薄层上的行为。

聚酰胺层析系统原理 其酰胺基可与酚羟基、羧基、羰基、硝基等形成氢键吸附。

聚酰胺是分离黄酮类化合物的比较理想的吸附剂，其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中酚羟基的数目、位置以及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。黄酮类化合物从聚酰胺色谱柱上洗脱大致遵循下列规律：

A. 化合物中酚羟基数目越多，被聚酰胺吸附越牢，越难洗脱。 酚羟基数目相同时，聚酰胺对邻位羟基吸附弱于间、对位，容易洗脱。 B. 共轭系统多的形成氢键能力强，因此黄酮类化合物骨架不同，聚酰胺的吸附能力也不同，吸附能力从小到大依次为：异黄酮 < 二氢黄酮 < 黄酮 < 黄酮醇

C. 有分子内氢键的羟基吸附弱 . D. 苷元相同，洗脱顺序一般是：叁糖苷，双糖苷，单糖苷，苷元

黄酮 定义：两个苯环（A与B环）通过三个碳原子相互联结而成的一系列化合物。（C6-C3-C6） 母核：2—苯基色原酮 O 1 2 3 6 4 5 7 8 1' 2' 3' 4' 5' 6' 母核：2—苯基色原酮 分布：多存在于高等植物中，是数量最多的天然酚性化合物。

性质 1．酸性 （1）来源：酚羟基（ 数目、位置） （2）酸性规律 a、7，4‘-OH酸性强于其他位置羟基的酸性（处于羰基对位，羰基的共轭诱导）。 b、5-OH酸性最弱（处于羰基邻位，形成分子内氢键）。 c、酚羟基数目越多，酸性越强。

应用：pH梯度法分离 NaHCO3 + - Na2CO3 NaOH 7，4′-OH > 7或4′-OH > 其他位-OH > 5-OH NaHCO3 + - Na2CO3 NaOH

2.碱性： 仅溶于强的、浓酸 +水 （浓硫酸） 烊 盐（呈色） 应用 初步鉴别黄酮母核类型：黄酮、黄酮醇 —— 黄~橙色，并有荧光 γ-吡喃酮环1-氧原子 微弱碱性（孤对电子，接受质子） 仅溶于强的、浓酸 +水 （浓硫酸） 烊 盐（呈色） 应用 初步鉴别黄酮母核类型：黄酮、黄酮醇 —— 黄~橙色，并有荧光 二氢黄酮 —— 橙红（冷）、紫红（热） 查耳酮 —— 橙红~洋红 异黄酮（二氢）—— 黄色 橙酮 —— 红~洋红

显色反应 1．还原显色反应 反应类型 鉴别特征 鉴别意义 备注 盐酸-镁粉 黄酮、二氢黄酮、 红~紫红 黄酮类特征性 假阳性 反应类型 鉴别特征 鉴别意义 备注 盐酸-镁粉 黄酮、二氢黄酮、 红~紫红 黄酮类特征性 假阳性 反应 黄酮醇、二氢黄酮醇 红~紫红 鉴别反应 （花色素） （最常用） 查耳酮、橙酮、 （-） 儿茶素类、异黄酮 （-） 四氢硼钠 二氢黄酮、二氢黄酮醇 红~紫红 二氢黄酮类特有 还原反应 其它黄酮类 （-） 钠汞齐反应 黄酮、二氢黄酮 红 异黄酮、二氢异黄酮 红 黄酮醇类 黄~淡红色 二氢黄酮醇类 棕黄色

2.与金属盐类试剂的络合反应： 三氯化铝反应：4′或7，4′-OH黄酮显天蓝色荧光。

补骨脂-化学成份 补骨脂是一些高等生物中发现的杂多环式化合物，补骨脂主要含黄酮类、香豆素类、单萜酚类等成分。 1.黄酮类 包括补骨脂二氢黄酮(补骨脂甲素、补骨脂乙素)、补骨脂双氢黄酮甲醚、异补骨脂双氢黄酮、补骨脂查耳酮、异补骨脂查耳酮、新补骨脂查耳酮、补骨脂异黄酮、新补骨脂异黄酮、补骨脂异黄酮醛等。 2.香豆素类 包括补骨脂内酯、异补骨脂内酯(异补骨脂素白芷素)、补骨脂定、异补骨脂定、双羟异补骨脂定。 3.单萜酚类如补骨脂酚。 4.其他 尚含补骨脂醛、豆甾醇、β-谷甾醇葡萄糖苷、脂肪油、葡萄糖、挥发油、生物碱等。

补骨脂甲素(coryfolin) ：分子量324.36。无色针状结晶，mp.191～192℃。 补骨脂乙素(isobavachalcone) ：分子量324.36。黄色片状结晶，mp. 166～167℃。

二氢黄酮类：2、3位双键被氢化而成。

补骨脂甲素、乙素结构差异 补骨脂乙素 补骨脂甲素 二氢黄酮和查尔酮，异戊烯基取代位置不同使得两者的极性差异

补骨脂乙素次生代谢产物转换 查尔酮 双键断裂与-OH形成环合 二氢黄酮

提取分离流程图

新购聚酰胺 通常有两种杂质：一种是蜡质（锦纶丝在制成以后，表面涂有一层蜡）。另一种是原料单体及其小分子聚合物。 这些杂质必须除去，否则原料单体及其小分子聚合物可与酚类物质形成复合物。

聚酰胺前处理方法 聚酰胺以90-95%乙醇浸泡，不断搅拌，除去气泡后装入柱中。 用3-4倍体积的90-95%乙醇洗脱。 再依次用2-2.5倍体积5%NaOH水溶液、1倍体积的蒸馏水、2-2.5倍体积的10%醋酸水溶液洗脱，最后用蒸馏水洗脱至pH中性

碱提酸沉法     黄酮类化合物易溶于碱水，难溶于酸水，因而可用稀碱水溶液提取，酸化使黄酮类化合物沉淀析出，达到纯化的目的。注意酸碱的浓度合适，并及时处理以免苷发生水解。

定性及鉴别反应 盐酸-镁粉 1ml样品，少许镁粉，加2滴HCl观察颜色变化。 思考其原理？ 四氢硼钠反应原理？ 三氯化铝反应原理？ 薄层色谱 聚酰胺板 补骨脂甲素、乙素对照品及样品点样 75%乙醇展开

思考 黄酮化合物在聚酰胺上洗脱顺序 黄酮化合物在聚酰胺色谱柱上保留时间 黄酮化合物定性鉴别反应原理