第十章 色层分离法 色层法基本概念 亲和层析 染料层析 疏水层析 离子交换层析 吸附色谱法 凝胶层析法 色谱分离技术的应用

第一节 色层法基本概念 色层法（层析法、色谱法）的由来： 第一节 色层法基本概念 色层法（层析法、色谱法）的由来： 1903年，俄国植物学家Tewett向填充CaCO3的柱中注入植物色素的石油醚萃取物，然后用石油醚冲洗，发现柱中出现数条相互分离的色带，层析法的命名就是由此发现开始的。 层析系统的组成：固定相、流动相、泵系统和在线监测系统的四个部分组成。

色层分离方法的基本特点 分离效率高 应用范围广 选择性强 高灵敏度的在线检测 快速分离 过程自动化操作

一、色层技术的基本概念： 色层分离（Chromatographic Resolution，CR）也称色谱分离或层析分离 这一组相关技术包括：分配层析（色谱）、离子交换层析（色谱）、吸附层析（色谱）、凝胶层析（色谱）、亲和层析（色谱）等。 在实际应用中，又派生出了“染料层析、疏水层析、金属螯合层析、共价层析等”

色谱分离法：它是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质（如吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲和力、分配系数等）的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中。当各组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理化学性质的差别，而以不同速率移动，从而达到分离目的。 （一） 固定相 （二） 流动相 （三） 分配系数

（三）分配系数:分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用Kd表示， Kd=Cs/Cm。根据不同物质的分配系数差异而分离的方法有分配色谱、吸附色谱和凝胶色谱。（P157）

（四）解离常数kp和分离因素α 解离常数kp：吸附质浓度与吸附剂浓度乘积与吸 附复合物浓度比值 分离因素α：某一瞬间被吸附的溶质量占总量的分数，有称质量分布比。 通常α ≥0.8， kp ≥ 0.1mol/L, 样品量很大时, α >0.9，目标产物后流出来 样品量很小时， α=0 ，目标产物先流出来 通过洗脱液的体积和上样量的体积，可计算目标物质的α。

（五） 阻滞因素P159 阻滞因子Rf 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比

其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小 （六） 分辨率(分离度，R或Rs表示)

（七）色带变形和“拖尾现象” （八）正相色谱和反相色谱 （九）操作容量 （十）洗脱容积 （十一）色谱法的塔板理论 （十二）检测方法

（十）洗脱容积Ve:是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积，常用Ve 表示。当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve。 当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。

retention volume 洗脱体积又称保留体积

洗脱曲线:是指以流出液中交换离子的浓度为纵坐标，洗脱液体积为横坐标作图而得到的曲线。 或是指用洗脱溶剂，分段洗脱吸附了一定量目标物的固定相，每洗脱一次，就接收后检测一次，如用2mL/次的洗脱溶剂分段洗脱了4次，就检测4次目标物的含量，看看第几次洗脱（加前几次洗脱量）可将目标物较完全的洗脱下来。

洗脱曲线示意图

（十一）色谱法的塔板理论 塔板理论： ①假设色谱柱本质是不连续性，是由N个相同高度的 塔板联起来的。 ②每个塔板中，流动相和固定相均达到相平衡一次。 ③N越大，相平衡次数越多，分离效果越好。 塔板理论可以给出在不同瞬间，溶质在柱中的分布和 各组分的分离程度与柱高之间的关系。 “理论塔板高度”是指这样一段柱高，自这段柱中流出 的液体（流动相）和其中固定相的平均浓度成平衡。 可以把任何一块塔板上溶质的质量分数求出来。

二、色谱法的分类： 根据分离原理的不同来分类：**** 吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、 凝胶过滤色谱、亲和色谱等。

1. 吸附色谱（ adsorption  chromatography ）：         根据吸附剂表面对不同组分物理吸附能力的强弱差异而进行分离的方法。    2. 分配色谱 （partition  chromatography ）：根据不同组分在固定相中的溶解能力的差异而进行分离的方法。  3. 离子交换色谱（ion exchange chromatography ）       根据不同组分离子对固定相亲和力的差异而进行分离的方法。 4. 凝胶色谱 （gel chromatography ）： 又称排阻色谱法（ size exclusion chromatography）： 根据不同组分的分子体积大小的差异而进行分离的方法。  其中：以水溶液作流动相的称为凝胶过滤色谱法 ；以有机溶剂作流动相的称为凝胶渗透色谱法。  5. 亲和色谱法 (affinity chromatography)  利用不同组分与固定相中的配体特异性结合反应的 差异而进行分离的方法。。

三、色谱系统的操作方法（或称柱操作系统）： 柱色谱装置： 一般有蠕动泵、层析柱(色谱柱)、检测器、电脑、分部收集器、梯度混合器等构成。 柱色谱的基本操作过程：

1层析柱 2恒流泵 3分部收集器 4梯度混合器 5蛋白检测仪 6层析柜

■ 液 相 层 析 管 柱 系 统 ： 梯 度 制 造 器 泵 记录器 缓 冲 液 管 柱 胶 体 监 视 器 分 部 收 集 器 (2) 转 接 器 泵 (1) adapter 记录器 缓 冲 液 (3) (4) 管 柱 (5) 胶 体 监 视 器 分 部 收 集 器 說明文字

（一）装柱： 柱的分离效果与柱长成正比，与柱的直径成反比，一般柱长/直径=20~30。 （二）平衡： （三）上样量和上样体积： （四）淋洗和洗脱： （1）专一性洗脱： （2）非专一性洗脱： ①恒定洗脱： ②分步洗脱： ③梯度洗脱：

恒定洗脱：始终用同一种洗脱剂洗脱，凝胶层析多采用 这种洗脱方式。如果各组分对固定相的亲和力差异不大 ，其区带的洗脱时间间隔也不长，采用这种方法较为适 宜。但要注意必须选择合适的溶剂，才能使各组分的分 配系数较大。 分步洗脱：该方法按照洗脱能力递增的顺序排列，用不 同的洗脱液逐级洗脱。它主要对混合物组成简单、各组 分性质差异较大或需快速分离的物质适用。每次用一种 洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。 梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，应 梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以 指浓度、极性、离子强度或pH等。常用的是浓度梯度， 在溶液中也就是离子强度梯度。

（五）流速及控制： （六）分部收集： （七）检测和合并收集： （八）洗脱峰纯度鉴定： （九）脱盐和浓缩：

装柱和平衡： ■ 胶柱的装填方法： X 加上 reservoir 加上 adaptor 清 洗 胶 体 预 估 体 积 上 清 检 查 好 管 柱 是 否 畅 通 装 填 胶 体 沉 积 中 Gel 紧 密 堆 积 已 堆 积 静 置 胶 体 温 度 平 衡 缓 冲 液 平 衡 說明文字 暂 停 流 洗 继 续 流 洗 加 压 流 洗 Gel 1 2 X

第二节 亲和层析(Affinity chromatography,AFC )

载体活化、配基连接、吸附、洗脱

亲和层析(affinity chromatograp hy , AC) 是蛋白质纯化的一种重要的方法,它具有很高的选择和分离性能以及较大的载量。 只需要一步处理即可使某种待分离的蛋白质从复杂的蛋白质混合物中分离出来,达到千倍以上的纯化,并保持较高的活性。

一、基本原理 1、亲和色谱(Affinity chromatography , AFC)是专门用于纯化生物大分子的色谱分离技术 它是基于固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和能力的不同来进行相互分离的。它具有很高的选择和分离性能以及较大的载量。 只需要一步处理即可使某种待分离的蛋白质从复杂的蛋白质混合物中分离出来,达到千倍以上的纯化,并保持较高的活性。 2、是基于蛋白质可与另一种称做配基（体）的分子能发生特异的可逆结合;

亲和层析介质的制备和纯化过程

所谓配基（配体）是指能被蛋白质所识别并 与之结合的原子、原子团和分子。把待纯化 的某种蛋白质的特异配体,通过化学反应共 价连接到载体表面的功能基上构成配基。 3、亲和色谱的基本过程： 当含有目标蛋白的混合样品加到该配基上 时,目标蛋白即和其特异性的配基结合而吸 附在配基表面,而其他杂蛋白则被洗出。被 特异地结合在配基上的目标蛋白可用自由配 体分子或通过改变缓冲液的条件使之解吸 附,并进一步收集.

二、常用生物亲和关系有： （1）酶：S、S的类似物、抑制剂、辅酶、金属离 子 （2）抗体：抗原、病毒、细胞 （3）激素、维生素：受体蛋白、载体蛋白 （4）外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞、细胞表 面受体蛋白 （5）核酸：互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合酶 （6）细胞: 细胞表面特异蛋白、外源凝集素

三、基质活化方法与配基耦联的问题 P162 1、溴化氰法 2、环氧氯丙烷活化 3、对甲苯磺酰氯活化 4、参与电荷掩蔽 5、活化基团与配基密度测定 6、亲和介质吸附容量测定

第三节 染料层析 以合成的带三嗪环的染料作为亲和配基用 于亲和层析分离酶和蛋白质的方法。 三嗪染料是许多酶和蛋白质的极其有效地 吸附剂，最大的应用是分级血浆蛋白 P168。

第四节 疏水层析 将疏水性基团固定化到介质上，疏水基团 与蛋白质等生物大分子的疏水区作用。同 一疏水基团对不同蛋白质的疏水作用不 同；不同疏水基团对同一蛋白质的疏水作 用也有差异。 高盐浓度的条件有利于疏水层析。 P168

一、基本原理：依据不同酶所带电荷量的不同来进行分离的 第五节 离子交换层析 一、基本原理：依据不同酶所带电荷量的不同来进行分离的 将解离基团引入到惰性支持物上形成离子 交换层析中的固定相。 如果解离基团（带电配体）带负电，则能 结合阳离子，称为阳离子交换剂； 如果解离基团带正电，则能结合阴离子，称为 阴离子交换剂（如上图所示离子交换剂）。

分离蛋白质的层析介质叫离子交换剂， 而分离小分子物质的介质叫离子交换树 脂，它们有三个方面的区别，1、碳骨 架不同、2活性离子不同 3、应用不同

当 pH > pI时，蛋白分子带负电，可结合于阴离子交换剂上； 电荷密度越大，结合越牢，在柱中移动速度越慢，从柱中被洗脱掉的速度就慢。 不同的蛋白所带电荷不同，对离子交换剂的结合力就有差异，提供了分离酶混合物的可能性； 混合物中的各蛋白分子差异大，易分离；差异小，难分离；没有差异就不能分离。 最根本原理就是依据不同酶所带电荷量的不同来进行的

二、离子交换层析的载体 离子交换剂： 离子交换纤维素： 离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具 有松散的亲水性网状结构以及较大的表面积，大分 子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白质） 的交换容量比离子交换树脂大。 阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM 纤维素）等 阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维 素（DEAE纤维素）

离子交换纤维素 离子交换纤维素 离子交换纤维素

常用的离子交换剂 离子交换葡聚糖： 是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物（Sephadex G） Sephadex的优点如下： 亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小 电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快既有离子交换作用，又有分子筛效应 因而Sephadex是一类广泛应用的色谱分离介质

常用的离子交换剂 常用的离子交换葡聚糖包括： 阳离子交换剂 CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50 Sephadex C-25，Sephadex C-50 阴离子交换剂 DEAE-Sephadex A-25，DEAE- Sephadex A-50 QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50

常用的离子交换剂 离子交换琼脂糖： 离子交换琼脂糖是携带DEAE或CM基团的Sepharose CL-6B DEAE-Sepharose（阴离子型）和CM-Sepharose（阳离子型）的离子交换介质具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点。 对pH及温度的变化均较稳定尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因此具有稳定的外形体积，可在pH3～10和0～70℃范围内使用，改变离子强度或pH时，床体积变化不大。

三、离子交换树脂的操作 1、选择离子交换树脂的一般原则： 酸性物质用阴离子交换剂分离 碱性物质用阳离子交换剂分离 ◆反离子:强酸、碱性用H+，OH-,弱用Na+ Cl- 氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质， 可根据其pI值及离子化曲线来选择。 活性分子：亲水性基质的交换树脂 具体：种类、离子形式、交换量、颜色、 交联度、理化性质等。 被分离物质所带的电荷性质

离子交换介质的选择原则 - + 对pI=5的某酸性蛋白质 当蛋白质为阴离子时， 在pH5.5-9.0的范围内， 应首选DEAE纤维素； 等电点 蛋 白 质 净 电 荷 在pH5.5-9.0的范围内， 吸附阴离子交换剂 应首选DEAE纤维素； pH 当蛋白质为阳离子时， 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 在pH3.5-4.5的范围内， 吸附阳离子交换剂 应首选CM纤维素 - pH < pI（+） pH = pI（0） pH > pI（-）

种类选定 中性盐体系： 阴阳离子的脱除用强酸强碱剂 微量杂质的脱除也要用强酸强碱剂 强碱树脂分有I 和 II 型：I 型碱型强于II

交换能力强的离子： 用弱碱性或弱酸性离子交换剂； 如一般有机碱交换能力都强，多价金 属离子、生物碱、链霉素等都用弱酸性 离子交换剂，既容易吸附又容易洗脱。

中性或碱性体系中： 多价金属离子与弱酸阳离子交换强，易洗 脱，与强酸阳离子交换弱； 弱酸通常不用弱碱树脂，但用强碱树脂； 弱碱体系中： 阳离子交换用弱酸阳离子树脂； 弱酸体系中： 弱酸中的阴离子用弱碱阴离子树脂；

树脂形式的选择 中性盐溶液，交换后生成盐： 盐型弱酸弱碱树脂； 当量相当的游离、酸碱混合； 酸、碱条件下的离子： 游离碱或酸树脂； 盐中除酸、碱： 弱型树脂（强型会交换盐）；

颗粒、交联度和稳定性 A 颜色：浅色便于看色带，使用后色深、杂 质多色变深。 B 颗粒：20－80目，200－400目。 C 交联度：聚苯乙烯树脂交联度1－20％，常 用8％，交联度高，选择性好，交换速度 小。孔度与交联度关系密切。 D密度：0.4-0.8g/ml E稳定性：一般而言，聚苯乙烯树脂稳定 阳比阴稳定 盐比酸碱稳定

2 柱的操作 装柱：树脂高度一般约为柱高的90%。为防 止加试液时树脂被冲起，在柱的上端亦应铺 一层玻璃纤维（或隔板）。装好后，再用蒸 馏水洗涤（不少于2倍柱体积），备用。 上样：阳离子树脂可达交换容量的50％，阴 离子一般为10-20%。小于5％床体积（1％分 析）。 洗脱：用蒸馏水洗去多余的（没吸附的）样 品，然后用洗脱液（缓冲液，pH,离子强度） 淋洗，方法有等度，梯度等。

平衡 柱子装好后，要用所需的缓冲液（有一 定的pH和离子强度）平衡柱子。用恒 流泵在恒定压力下走柱子（平衡与洗脱 时的压力尽可能保持相同）。 补充 柱子装好后，要用所需的缓冲液（有一 定的pH和离子强度）平衡柱子。用恒 流泵在恒定压力下走柱子（平衡与洗脱 时的压力尽可能保持相同）。 离子强度和pH的选择首先要保证各个 待分离物质如蛋白质的稳定。使各个待 分离物质与离子交换剂有适当的结合 。 有时柱子平衡好后，还要进行转型处理。

离子交换层析的基本操作 层析柱平衡 补充 平衡缓冲液的用量至少为柱体积的 2 倍 平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速 平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准，其中pH值最重要

补充 交换 将试液加到交换柱上，用活塞控制一定的流 速进行交换。经过一段时间之后，上层树脂全部 被交换、下层未被交换，中间则部分被交换，这 一段称为“交界层”。随着交换的进行，交界层逐 渐下移，至流出液中开始出现交换离子时，称为 始漏点(亦称泄漏点或突破点)，此时交换柱上被 交换离子的物质的量数称为始漏量。在到达始漏 点时，交界层的下端刚到达交换柱的底部，而交 换层中尚有未被交换的树脂存在，所以始漏量总 是小于总交换量。

补充 洗脱 当交换完毕之后，一般用蒸馏水洗去残存溶液， 然后用适当的洗脱液进行洗脱。在洗脱过程中、上 层被交换的离子先被洗脱下来，经过下层未被交换 的树脂时，又可以再度被交换。因此最初洗脱液中 被交换离子的浓度等于零，随着洗脱的进行，洗出 液离子浓度逐渐增大，达到最大值之后又逐渐减小， 至完全洗脱之后，被洗出之离子浓度又等于零。 对于阳离子交换树脂常采用HCl溶液作为洗脱 液，经过洗脱之后树脂转为氢型；阴离子交换树脂 常采用NaCl或NaOH溶液作为洗脱液，经过洗脱之 后，树脂转为氯型或氢氧型。因此洗脱之后的树脂 已得到再生，用蒸馏水洗涤干净即可再次使用。

四 离子色谱的应用 1 纯水的制备 氢型强酸性阳离子交换树脂，除去各种 阳离子 2R-SO3H+Ca2+＝(R-SO3)2Ca+2H+ 1 纯水的制备 氢型强酸性阳离子交换树脂，除去各种 阳离子 2R-SO3H+Ca2+＝(R-SO3)2Ca+2H+ 氢氧型强碱性阴离子交换树脂，除去各 种阴离子。 RN(CH3)3OH+C1-＝ RN(CH3)3Cl+OH-

去离子水装置示意

水质检测 化学法：pH值 离子（Cl,Fe, Ca Mg,硫酸根等） 可溶性硅，氧化物 不挥发物 物理法：测定电阻率 超纯水18兆以上

再生 阳、阴离子柱再生： 混合床再生： 先对混合床进行碱洗，然后用水逆流 冲洗，使树脂运动，由于比重不同分 层，分出阳、阴树脂分别处理。

2 分析化学应用 干扰离子的分离 测定黄铁矿中硫， Fe3+、Ca2+的存 在，造成BaSO4沉淀的不纯。 Li+、Na+、K+混合液，通过阳离子 树脂交换柱，稀HCl洗脱。会按Li+、 Na+、K+顺序出来。 微量组分的富集

例如 铂、钯在矿石中的含量：一般为10-5-10-6g/100g， 即使称取10克试样进行分析，也只含铂、钯0.1微 克左右。 富集的方法是：称取100-200克，在700℃灼烧, 王 水溶解，加浓HCl蒸发，铂、钯形成PtCl62-和 PdCl42-络阴离子。稀释，过强碱性阴离子交换， 即可将铂富集在交换柱上。稀HCl将树脂洗净之， 取出树脂移入瓷钳锅中，在700℃灰化，用王水溶 解残渣，加盐酸蒸发。然后在8mol/LHCl介质中， 钯(II)与双十二烷基二硫代乙二酰胺(DDO)生成黄 色络合物，用石油醚-三氯甲烷混合溶剂萃取，用 比色法测定钯。铂(IV)用二氯化锡还原为铂 (II)，与DDO生成樱红色螯合物可进行比色法测 定。

3 用于水溶性带电荷植物成分分离 氨基酸、肽类（蛋白质）、生物碱、有 机酸、酚类等。 一般步骤： 用煎煮法或温浸法得到植物有效成分 水溶液，然后过强酸型阳离子交换树脂 柱、强碱型阴离子交换柱，分别洗脱， 可得到一些单一成分。

植物成分离子交换分离

4 蛋白质或酶的分离 聚苯乙烯离子交换树脂：吸附牢，易变 性 离子交换纤维素:最好的方法 离子交换凝胶：同时有离子交换和分子 筛的功能，广泛应用。 选弱酸、碱型为好，强型容易使蛋白变 性 树脂形式不用H, OH型：

第六节 吸附层析法 一、 吸附层析基本原理 吸附层析法是指混合物随流动相通过吸附剂时，由于该吸附剂对不同物质有不同的吸附力而使混合物分离的方法。该法是最早期的一种色谱分离技术，主要应用于某些分子量不大的物质的分离提纯，个别的如羟基磷灰石也适用于生物大分子的分离提纯，应用范围比较广。

二、羟基磷灰石层析[hydroxyapatite,Ca10(PO4)6(OH)2 ] 羟基磷灰石（HAP）是脊椎动物骨骼和牙齿的主要组成，是一种唯一能够用于蛋白质、核酸等大分子分离的无机吸附介质。它可能是由于偶极离子作用而进行的分离。特点如下： 1、洗脱不受盐浓度影响（可以用盐来洗脱） 2、将羟基磷灰石改性，固定在交联琼脂糖凝胶中制得蛋白质吸附剂（HA-Ultrogel），可以用来分离分子量或电荷量非常接近的蛋白质。如麦芽外源凝聚素（WGA，分子量36000）和琥珀酰麦芽外源凝聚素（ Suc-WGA ）的分离。

三、薄层层析 薄层色谱

常用的吸附剂有：1）氧化铝 分为碱性、中 性和酸性，在一定温度下除去水分可使氧化 铝活化； 2）硅胶：一般采用含水量10-20%的硅胶。 活化条件是指在150-195℃加热2-3h硅胶。 3）聚酰胺 特别适合低分子量化合物的分 离，如酚、羧酸、DNP-氨基酸、醌及芳香族 化合物等。 4）活性炭 分为粉末、颗粒和锦纶活性炭， 其吸附能力在水溶液中最强，活化条件150℃ 加热4-5h。

第七节 凝胶层析法（gel filtration chromatography） 凝胶层析又称凝胶过滤层析、凝胶排阻层析， 分子筛层析等。它主要用于分离分子大小不同 的的样品。凝胶层析设备简单，操作简便，每 次层析后无需再生处理，因此在生化研究中应 用极其广泛。 1、基本原理 2、凝胶层析的介质 3、凝胶过滤的操作及应用

1、基本原理 凝胶层析载体是多孔凝胶。 当溶质通过层析柱时，分子直径比凝胶 孔径大的分子，不能进入凝胶颗粒的微 孔里，只能随溶剂一起移动的，最先流 出柱外； 分子直径比凝胶孔径小的分子，即进入 凝胶相内，延长了路径，向下移动的速 度落后于大分子。这种情况如下图所示。

■装于柱中的凝胶支持物及某些层析参数示意图 依据 分子大小、 形状 样本 小分子 流 动 相 固 定 相 大分子 圖 3.2 膠體過濾法的原理： 小分子 被延滯 较快流出 返回

■ 管柱內胶体的组成区间： 胶 体 外 积 胶 体 內 积 管 柱 总 体 积 流 动 相 固 定 相 說明文字 Vt Vo Vt - Vo

A ■ 凝胶过滤的溶离图谱： Elution Volume (mL) Y X E Z Vo Vt 目标酶 (E) 最好不要落在 应有物质 溶离出來 X E Vo Vo 之前不应有 物质溶离出來 Enzyme activity Z NaCl Vt 圖 3.4  膠體過濾法的典型溶離圖譜： Elution Volume (mL)

■ 胶体粒子的粗细会影响溶离液的流动： 胶体的颗粒越小 其解析力越大 但流速变慢 上圖誇張管柱內粒子的大小，以說明對解析力或流速的影響。 粒子之間的空間，是造成解析力不好的原因之一；將粒子變小，可降低此空間，也因此可增加解析力。 胶体的颗粒越小 其解析力越大 但流速变慢

凝胶层析的原理

Kd=(Ve-Vo)/Vi Ve 、 Vo 、 Vi的含义：P175

2、凝胶层析的介质 对凝胶层析支持物的要求是： 第一：要有惰性，即凝胶介质与溶质不发生任何作用； 第二：离子基团含量要低，即所带电荷要尽可能低； 第三：凝胶颗粒的孔度和大小要均一； 第四：凝胶颗粒和孔度大小的选择范围要宽，能适应 各种不同大小的分子的分离； 第五：机械强度要高。 现在有3种介质在不同程度上满足这些要求。 返回

胶体的种类: （1）葡聚糖凝胶: 用1,2-环氧氯丙烷作交联剂,将由葡萄糖经-1,6糖苷键结合而成的线性葡聚糖聚合成高分子聚合物。商品名为Sephadex (G-10  200 共8种，G后面的阿拉伯数为每克干凝胶吸水ml数的10倍。 ) 如：Sephadex G-25每克干凝胶吸水2.5ml。 Sephadex G-25 比 G-100 交联度大，所以膨胀度、吸水量和筛孔直径前者小于后者，前者对球形蛋白质的分级范围较窄 ，即1000（下限）~5000（上限）之间，而后者较宽，在4000~150000之间。

（2）琼脂糖凝胶：由D-半乳糖和3,6-脱水L-半乳糖相间结合形成的多糖,是将琼脂中含硫酸根和羧基基团的琼脂胶除去而得到的。按其浓度可以分为Sepharose 2B（表示琼脂糖为2%浓度）、4B （4%浓度）、和6B （6%浓度）等 。 2B的筛孔大于6B，但机械强度小于6B。

（3）聚丙烯酰胺凝胶： 丙烯酰胺经交联剂甲叉双丙烯酰胺聚合而成的高分子聚合物。商品名为Bio-Gel-P。(从P-2至P-300共10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。 ) 一般来说，编号乘以1000大多数是它的排阻极限。

优点 条件温和 操作简便 损失少回收率高 层析柱可反复使用

凝胶的前处理 溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。 碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。 酸洗：用0.5 M HCl 溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。 平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同。

3.凝胶及凝胶柱的选择 根据不同分子量选择不同凝胶 Sephadex: 交联葡聚糖 G-10，15，25，50， 75，100，150，200；吸水值乘以 10。 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡 聚糖凝胶

■ 层 析 管 柱 的 形 状 ： 300 cm3 矮 胖 型 细 长 型 ● 矮胖型管柱分离不佳 其流速及容量均较大 30 cm2 說明文字 ● 矮胖型管柱分离不佳 其流速及容量均较大

凝胶柱的选择

装柱 将层析柱垂直固定，加入适量溶剂排走空气。 将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至1/4~1/3高时打开下端出口，让溶剂慢慢流出，继续侵入凝胶至沉降到所需高度。装柱时要注意操作压。 用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使交换剂充分平衡，柱床稳定。

样品上柱、洗脱、 收集。 如图装好层析装置，打开下端出口，使溶液流出至刚好达到凝胶胶面 沿柱壁缓慢加入2ml样品，打开下端出口，使样品溶液流出至刚好达到凝胶胶面，再取少量起始缓冲液洗涤柱壁。 打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。 用自动部分收集器自动或手动收集，合并同一高峰各管。

层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支掌滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000。 凝胶的再生及保存 再生 用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶液分别处 理后可以恢复其性能 凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠或0.002%双氯苯双胍己烷

应用： 一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的Sephadex G-200效果好。 a. 分离蛋白质：选用Sephadex G-200 b.蛋白质分子量的测定 c.脱盐：选用Sephadex G-25 d.浓缩：选用Sephadex G-25 e.纯化青霉素 一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的Sephadex G-200效果好。 脱盐用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。

本章小结： 1、重点 2、难点： 思考题： 1、什么是色谱分离法？ 2、什么是柱操作系统？ 3、各种色谱分离（吸附、离子交换、凝胶、亲和）的机理和应用范围。 4、离子交换树脂和离子交换层析剂两种技术有何异同？

5、要想获得更好地层析分离效果，色谱柱的长度和直径有何要求？ 6、什么是梯度洗脱法？如何选择离子交换色谱的洗脱剂？

第三节 分配色谱法 一、基本原理 1

一.分离原理：将液体均匀地涂渍在惰性物质(载 体)表面上作为固定相，利用被分离组分在固定 相与流动相中的溶解度差别所造成的分配系数差 别而被分离。 狭义分配系数 注：K与组分的性质、流动相的性质、固定相的性质 以及柱温有关

二、载体(惰性物质) 作用：负载固定向 要求： 1、惰性、没有吸附能力、能吸留较大 量的固定相液体 2、纯净、颗粒大小均匀 常用载体：硅胶、硅藻土、纤维素

硅胶：1、优点吸水量大 2 、规格不同，结果不易重现 硅藻土：常用，但几乎不发生吸附作用 纤维素：纸色谱载体，分配柱色谱常用载体 此外，还有淀粉及有机载体（微孔聚乙烯粉）

三、固定相及其选择 正相分配色谱：极性——固定相>流动相 极性小的组分先流出，极性大的组分后流 出。 应用于分离极性及中等极性物质 正相分配色谱：极性——固定相>流动相 极性小的组分先流出，极性大的组分后流 出。 应用于分离极性及中等极性物质 固定相有水、各种缓冲溶液、稀硫酸、甲 醇、甲酰胺、丙二醇等强极性溶液及它们 混合液等按一定比例与载体混匀后，填装 于色谱柱，用被固定相饱和的有机溶剂做 洗脱剂进行分离，被分离成分中极性大的 亲水性成分移动慢

反相分配色谱：极性——流动相>固定相 极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。 应用广泛，用于分离非极性至中等极性物质。　 常用硅油、液体石蜡等极性较小的有机溶剂作为固定液，而以水、水溶液或与水混合的有机溶剂作为流动相。此时，被分离成分的移动情况与正相分配色谱相反

四、流动相及其选择 一、正相色谱常用的流动相有石油醚、醇 类、酮类、酯类、卤代烷及苯等。 二、反相色谱常用的流动相有水、各种水 溶液、低级醇类 固定相和流动相的选择要根据被分离物中 各组分在两相中的溶解度之比即分配系数 而定，即在流动相中加入一些别的溶剂， 以改变各组分被分离的情况与洗脱速率。

五、分配色谱基本操作 装柱 加样 洗脱