流式细胞仪 分析技术及应用

FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。

特点: 单细胞的流动的 活细胞的 定量的 多参数的 高统计学精度的 分选细胞

第一节 流式细胞仪的分析及分选原理 第二节 数据的显示与分析 第三节 流式细胞仪分析的技术要求 第四节 流式细胞术在免疫学检查中应用

第一节 流式细胞仪的分析及分选原理 一 工作原理： FCM是一种在计算机技术支持下的高度 自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。

(一） 基本组成构 1、液流系统 样品流和鞘流 2、光学系统 激光、透镜组、 光电倍增管等。 3、数据处理系统

1、液流系统 样品流和鞘流 Injector Tip Sheath fluid 荧光信号 激光束

2、光学系统 激光、透镜组、光电倍增等。 Laser Dichroic Flow cell Filters Bandpass Filters PMT 4 PMT Dichroic 3 Flow cell Filters PMT 2 Bandpass Filters PMT 1 Laser

（二） 基本工作原理

单细胞流：流动室

单细胞照明：激光 488 nm laser

单细胞检测：信号处理 488 nm laser

二 散射光的测定 信号的强弱与细胞的大小相关 （一）前向散射光 (foword scatter)：FSC （二）侧向散射光（side scatter)：SSC 信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关

Forward Angle Light Scatter FALS Sensor Laser 细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.

90 Degree Light Scatter 细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关. Laser FALS Sensor

前向散色光FSC

侧向散色光SSC

散射光的测定 利用前向角和 测向角散射光可 以把外周血白细 胞分成三群，淋 巴细胞、单核 细胞和粒细胞。

三 荧光测量 荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长 （一）光信号测量 线性放大器 对数放大器

PE-TR Conj. Texas Red PI Ethidium PE FITC cis-Parinaric acid Common Laser Lines 600 nm 300 nm 500 nm 700 nm 400 nm 457 350 514 610 632 488 PE-TR Conj. Texas Red PI Ethidium PE FITC cis-Parinaric acid

Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm DNA

（二）荧光补偿 利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻 荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿”

Fluorescence detector 四 细胞分选原理 （一）分选的基本原理 488 nm laser FALS Sensor Fluorescence detector - + Charged Plates Single cells sorted into test tubes

MACS-Magnetic Cell Sorting 磁珠分离 阳性选择 阴性选择

（二）分选的技术要求 1 、分选速度：几千个细胞/秒 2 、分选纯度:99.5%左右 3 、分选收获率:90-95% 4 、分选得率

分选纯度 是指分离后的样品中该亚群细胞 所占的百分比。 分选收获率 是指分离后所得的细胞亚群数占原 细胞样品中该亚群细胞数的百分比。

第二节 数据的显示和分析 一、参数 前向散射光FS: 反映颗粒的大小 侧向散射光SS: 细胞内部结构复杂程度 荧光FL: 细胞被染上荧光部分数量的多少

二、数据的显示方式 （一） 单参数直方图 （二） 双参数显示 （三） 三参数显示

(一) 单参数直方图的显示 以分布直方图( distribution histogram ) Single-Parameter Histogram Displays 以分布直方图( distribution histogram ) 来显示，横轴为该参数测量强度相对值，单位是 道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。 纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数。

X轴表示绿荧光信号(CD3)强弱,Y轴则反应细胞的数量.

(二)双参数数据的显示 Two-Parameter Data Displays 细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞 数量的关系，更重要的是获得了这二个参数之间的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。双参数数据显示最常用的是二维的散点图( Dot Plot )。在二维图上，横轴代表第一个测量参数，纵轴代表第二个测量参数。

1 、点图 纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量 参数,在图中每一个点代表一个细胞

2 、二维等高图 用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相 同，不同的等高线上细胞数不同。

3 、假三维等高图 纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参数,Z轴为细胞数。

(三) 三参数直方图 三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而非细胞数。

一般利用所得参数的两两组合并利用设门（Gate) （四）流式细胞仪的多参数分析 一般利用所得参数的两两组合并利用设门（Gate) 技术，来分析参数之间的相互关系。

1 、Region设置

2 、 设置 Gate

第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 样品制备：单细胞悬液 特定荧光染料的选择：光谱重叠 阴性对照的设置:检测标本的重复性 质量控制

一、免疫检测样品制备 细胞碎片 细胞团块 离心漂洗 固定剂

（一）外周血淋巴细胞样品的制备 淋巴细胞分离液分离外周血中单个核细胞。 Ficoll,40kd，高密度，低渗透压，无毒性。 （比重为1.0177±0.001的分层液).

利用红细胞裂解液去除红细胞后，得到外周血 中所有白细胞的流式细胞分析的二维散色光点图

（二) 培养细胞的样品制备 单层培养细胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法 使细胞从培养皿上消化下来，然后离心漂洗。 悬浮培养细胞，可不用酶消化，直接吹打制备 成单细胞悬液。

机械法：剪碎法、网搓法、研磨法。 (三)新鲜实体组织单细胞悬液的制备 酶处理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原酶等。 化学试剂处理法：EDTA、EGTA等。 表面活性剂处理法： Triton-100、皂素等。

机械法往往常成严重的细胞损伤，而结果却是较低的细胞产量。 如用低速离心去碎片，用尼龙网过滤团块等， 也可利用电子学技术处理的方法排除团块和碎片 的干扰。 酶学法、化学法对实体组织的分散效果较理想，但会造成所测化学成份的不良影响。FCM所测细胞是单个分散状态；对细胞团块，细胞碎片尽可能 少；细胞的活性不受损害，以保证下一步的荧光 染色处理不受影响。

(四）单细胞悬液的保存 防止细胞自溶，保持细胞膜原有的特性保存的方法： 1、深低温保存法：深低温冰箱，保存一年。 2、乙醇与甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。 3、甲醛或多聚甲醛固定法：细胞不具有生物活性，但 细胞表面荧光染色分析不受影响。

染料的选择和标记染色保证了荧光信号的产生 二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 染料的选择和标记染色保证了荧光信号的产生 （一）免疫荧光标记最常用的荧光染料 荧光染料 激发波长（nm) 发射波长（nm) 颜色 FITC 488 525 深蓝色 PE(RDI) 488 575 橙色 ECD 488 620 橙红色 PeCy-5 488 670 红色 PeCy-7 488 755 深红色 PI 488 620 橙红色 APC 633 670 红色 FITC 488 525 深蓝色 PE(RDI) 488 575 橙色 ECD 488 620 橙红色 PeCy-5 488 670 红色 PeCy-7 488 755 深红色 PI 488 620 橙红色 APC 633 670 红色

能量传递染料： 用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在 488nm波长激发光激发后产生的发射波长激发另一荧光 染料产生的荧光信号。 Laser CY5 CY5 488nm PE CY5

（二）免疫荧光标记 荧光染料与细胞成分的结合方式： 结构亲和方式 嵌入结合方式 共价结合方式 荧光抗体特异性结合方式 1、直接免疫荧光染色 2、间接免疫荧光染色

3、双或多参数荧光抗体的组合标记 荧光染料 激发波长（nm) 发射波长（nm) 颜色 FITC+PE 488 525 、575 绿色、橙色 FITC+T red 488 525 绿色 568 615 红色 FITC+PeCy5 488 525、 675 绿色、 红色 FITC+ ECD 488 525、 625 绿色、橙红色 F+P +PeCy5 488 525、575、675 绿、橙、红色 F+ ECD +PeCy5 488 525、575、675 绿、 橙红色、红色 F+P+APC 488 525 、 575 绿色、橙色 633 670 红色

(三) 细胞的自发荧光 FITC的激发 波长处于自发 荧光的光谱区 内，因此FITC 荧光易受自发 荧光的干扰。

三、流式细胞免疫学技术的质量控制 （一）单细胞悬液制备的质量控制 （二）细胞悬液免疫荧光染色的质量控制 1、温度对荧光染色的影响 2、pH对荧光发射强度的影响 3、荧光染料浓度的控制 4、固定剂对荧光染色的影响 （三）仪器操作技术的质量控制

（四）免疫检测的质量控制 1、同型对照：选用相同源性的未标记单抗作为 同型对照（阴性对照） 2、全程质控：在流式检测中，样品标记、溶血、 洗涤、仪器质量控制和上机检测的过程都会直接影 响检测结果。采用标准质控样品来进行全程质控， 使得同类实验室建立质控比对，数据可以互用。

第四节 流式细胞在免疫学检查中的应用 一、淋巴细胞及其亚群的分析 淋巴细胞是机体免疫系 统中的一群重要细胞群， 是参与免疫调节和执行细 胞免疫功能的免疫活性细 胞，T细胞、B细胞和NK 细胞，各自发挥不同的作 用。

三色标记 淋巴细胞 T、 B、 NK

（一）淋巴细胞及其亚群分析 1、Th 细胞： CD3+ CD4 + CD8- T细胞，能辅助B 细胞分化成熟生 成抗体产生细胞 （桨细胞），参 与促进细胞介导 的免疫应答。

2、Tc细胞： CD3+ CD4 - CD8 +T细胞， 能特异性直接杀伤 靶细胞，所有表达 MHC I类分子的靶 细胞。抗肿瘤免疫， 抗病毒感染，移植 排斥反应和自身免 疫疾病中均起了重 要作用。

(二）B淋巴细胞及其亚群 B细胞约为5%-10%，标志 为BCR，膜表面免疫球蛋白 （Smlg）。表达CD19、 CD20、CD21、CD22分子。 B细胞也是免疫系统重要 的免疫细胞，主要功能是 介导体液免疫。抗原递呈 细胞，能摄取、加工和递 呈抗，同时还能分泌细胞 因子调节免疫应答。

（三）NK细胞分析 自然杀伤细胞（Natural killer cell,NK 细胞）为一 组大颗粒的淋巴细胞，5%-10% 左右，标志CD16、CD56、 CD2、CD11a/CD18。用三色荧光标记将CD3-CD16+CD56+淋巴 细胞定为NK细胞。主要功能是参与细胞免疫，在肿瘤免疫 抗病毒感染中均起重要作用。

二、淋巴细胞功能分析 （一）细胞介导细胞毒性试验 （二）细胞内细胞因子测定 小分子可溶性蛋白质 T细胞和巨噬细胞 参与细胞免疫、体液免疫、炎症反应、造血调控、 细胞增殖和分化、损伤修复重要生理和病理过程。

流式细胞细胞因子分析图

流式细胞细胞因子分析图

三、淋巴造血系统分化抗原 及白血病免疫分型 用多参数 FCM测定白血病免疫表型可以把病人 血液中幼稚的白血病细胞和正常的白细胞区分开。 根据白血病细胞所表达相关细胞的种系抗原，将白血病细胞分为B细胞系(CD19,CD20),T细胞系(CD7,CD3)，髓细胞系(CD13,CD33)以及红细胞系(glycophorin A)和巨噬细胞系(CD61)。

幼稚白血病细 胞的表型分析

四、肿瘤耐药基因分析 在肿瘤病人使用化疗药物中，会产生药物的耐受。当检测患者外周的淋巴细胞表达MDR阳性细胞时，说明患者对化疗药物开始出现耐药性。提示临床医生应更改治疗方案。

五、在AIDS病检测中的分析 艾滋病又称获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒（HIV)感染人体后产生的Th细胞受损而导致全身免疫功能下降。

六、自身免疫性疾病相关HLA 抗原分析 强直性脊柱炎 HLA-B27/HLA-B7双标记 FCM检测：病人58%-97% 正常人仅2%-7%