第六章 微生物的生长及其控制 细菌在进化上取得的最重要的成果是它们在多种环境条件下能迅速、有效地生长。 第六章 微生物的生长及其控制 细菌在进化上取得的最重要的成果是它们在多种环境条件下能迅速、有效地生长。 ——J.L.Ingraham, O.Maal和 F.C.Neidhardt

生长（growth）： 繁殖（reproduction）： 生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。 生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。

个体生长 → 个体繁殖 → 群体生长 群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖 研究目标：群体生长

问题：微生物生长的测定指标有哪些? 细胞数量的增加 细胞群体的总重量的增加

教学内容 第一节 测定生长繁殖的方法（重点，掌握） 第二节 微生物的生长规律（重点，掌握） 第三节 影响微生物生长的主要因素（熟悉） 第一节 测定生长繁殖的方法（重点，掌握） 第二节 微生物的生长规律（重点，掌握） 第三节 影响微生物生长的主要因素（熟悉） 第四节 微生物培养法概论（了解） 第五节 有害微生物的控制（重点，掌握）

第一节 测定生长繁殖的方法 生长量的测定 繁殖量的测定

测定生长繁殖的方法 适用于一切微生物 直接法 称干重（精确型） 测生长量 比浊法 间接法 测含碳量 生理指标法 测含氮量 测体积（粗放型） 直接法 称干重（精确型） 测生长量 比浊法 间接法 测含碳量 生理指标法 测含氮量 其它（P 、DNA）

只适宜于单细胞微生物 直接法 ——血球计数法 计繁殖数 间接法——平板菌落计数法

干重法是测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法。 一、测生长量 直接法——干重法 离心或过滤 60、80或 105℃烘干 干 重 法 菌液 菌体细胞 称重 湿重 干重 微生物的干重一般为其湿重的10％～20％ 干重法是测定多细胞及丝状真菌生长情况的有效方法。

间接法——比浊法 比浊法 原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下（450-650nm)测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。

在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度（optical density, 即O.D.）表示菌量。 实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。

注意 1、测得结果既包括活菌又包括死菌； 2、样品颜色不宜太深； 3、样品中不应含有杂质； 4、菌悬液浓度在107/ml以上时才能显示出可信的浑浊度。

二、计繁殖数 直接法——血球计数板法

血球计数板法 每毫升样品中含菌量： 中方格细胞数量☓25 ☓10 ☓103 ☓稀释倍数

适用范围：个体较大的单细胞或颗粒，如酵母菌以及真菌孢子等。不适用于细菌等个体较小的细胞以及多细胞微生物，因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。 缺点：此法得到的数目是包括死细胞在内的总菌数。

间接法——活菌计数法 平 板 菌 落 计 数 法 涂布平板法（spread plate） 浇注平板法（pour plate） 这是一种依据活菌在固体培养基上（内）会形成肉眼可见的菌落的原理而设计。 涂布平板法（spread plate） 浇注平板法（pour plate）

复习 1、测量微生物生长繁殖的方法 测 土 壤 微 生 物 的 细 菌 数 量 常 采 用： A. 血 球 板 计 数 法 B. 涂 布 计 数 法 C. 比 浊 法 D. 干 重 法

第二节 微生物的生长规律

微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物群体繁殖生长。 微生物的特点： 个体微小 肉眼看到或接触到的微生物是成千上万个 单个的微生物组成的群体。 微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物群体繁殖生长。 对细菌群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础

一、微生物的个体生长和同步生长 如何研究微生物的个体生长？

目前使用的方法： （1）电子显微镜观察细胞的超薄切片

（2）同步培养（synchronous culture ）技术 设法使某一群体中的所有个体细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中，通过分析此群体在各阶段的生物化学特性变化，来间接了解单个细胞的相应变化规律。

这种通过同步培养的手段而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态，称为同步生长（synchronous growth）。

获得微生物同步生长的方法： （1）环境条件诱导法 氯霉素抑制细菌蛋白质合成； 细菌芽孢诱导发芽等。 （2）机械筛选法 利用处于同一生长阶段细胞的体积、大小的相同性，用过滤法、区带密度梯度离心法或膜洗脱法收集同步生长的细胞。

二、单细胞微生物的典型生长曲线 生长曲线（Growth Curve）： 典型生长曲线: 什么是“典型”生长曲线? 将少量纯种单细胞微生物，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，得到一条由延滞期、指数期、稳定期和衰亡期4个阶段组成的曲线。

稳定期 指数期 衰亡期 延滞期 根据微生物的生长速率常数（growthrateconstant），即每小时的分裂次数（R）的不同，一般可把典型生长曲线粗分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等4个时期 。

（一）延滞期（Lag phase） 又称停滞期、调整期和适应期。指少量单细胞微生物接种到新鲜培养基后，在开始培养的一段时间内，因代谢系统适应新环境的需要，细胞数目不立即增加，或增加很少的一段时期。 延滞期

分裂迟缓、代谢活跃 1. 延滞期的特点 一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大！ ① 生长速率常数（R）为零； ② 细胞形态变大或增长，许多杆菌可长成丝状， Eg.巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）在延滞期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍； 一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大！

在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。 ③ 细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性； ④ 合成代谢十分活跃，核糖体、酶类和ATP合成加速，易产生各种诱导酶； ⑤ 对外界不良条件如NaCI溶液浓度、温度和抗生素等理化因素反应敏感。 细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓。 在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。

2. 迟缓期出现的原因 调 整 代 谢 微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。

3. 影响延滞期长短的因素 （1）菌种的遗传性 （2）接种龄 指接种物或种子（inoculum，复数inocula）的生长年龄，亦即它处在生长曲线上哪一个阶段时用来作种子的。这里指某一群体的生理年龄。

种子的接种龄 子代培养物的延滞期 对数期 短 稳定期 居中 延滞期或衰亡期 长

（3）接种量 接种量的大小明显影响延滞期的长短。 接种量小 延滞期长 接种量大 延滞期短

在发酵工业上，为缩短延滞期以缩短生产周期，提高发酵效率，一般采用较大的接种量。 种子：发酵培养基＝1：10，V/V

天然培养基 营养丰富 延滞期短 组合培养基 营养单调 延滞期长 （4）培养基成分 天然培养基 营养丰富 延滞期短 组合培养基 营养单调 延滞期长 发酵培养基 发酵生产中 成分尽量接近 种子培养基

4. 生产实践中缩短延滞期的常用手段 （1）通过遗传学方法改变种的遗传特性使延滞期缩短； （2）利用对数生长期的细胞作为种子； （3）尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大； （4）适当扩大接种量；

（二）对数生长期（ Logarithmic phase ） 指数期 又称指数生长期（Exponential phase）。指在生长曲线中，紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的时期 。

1. 对数生长期的特点 ① 生长速率常数R最大，因而细胞每分裂一次所需的时间——代时（generation time ，G，又称增代时间）或原生质增倍时间最短； ② 细胞进行平衡生长（balanced growth），菌体各部分的成分十分均匀； ③ 酶系活跃，代谢旺盛；

指数期的微生物因其整个群体的生理特性较一致、细胞成分平衡发展和生长速率恒定，故可 2. 应用: 指数期的微生物因其整个群体的生理特性较一致、细胞成分平衡发展和生长速率恒定，故可 ①作为代谢、生理等研究的良好材料， ②由于此时期的菌种比较健壮，是增殖噬菌体的最适宿主菌龄， ③也是发酵生产中用作“种子”的最佳种龄。

3. 对数生长期的3个重要参数 （1）繁殖代数（n） x2=x1·2n lgx2–lgx1

（2）生长速率常数（R） n 3.322（lgx2–lgx1） R = ———————— = ———————————————— t2–t1 t2–t1

（3）代时（G） 又称增代时间 1 t2–t1 G = ———— = ———————————————— R 3.322（lgx2–lgx1） 在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间为代时（Generation time）。 ★代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速率快，代时长，生长速率慢。在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时。

影响微生物增代时间（代时）的因素 1）菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同； 菌名 培养基 培养温度 代时 E. coli（大肠杆菌） 肉汤 37℃ 17min E. coli 牛奶 37 12.5 Enterobacter aerogenes（产气肠细菌） 肉汤或牛奶 37 16~18 E. aerogenes 组合 37 29~44 B. Cereus（蜡状芽孢杆菌） 肉汤 30 18 B. thermophilus（嗜热芽孢杆菌） 肉汤 55 18.3 Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳杆菌） 牛奶 37 66~87 Streptococcus lactis（乳酸链球菌） 牛奶 37 26 S. lactis 乳糖肉汤 37 48 Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌） 肉汤 37 23.5 Azotobacter chroococcum（褐球固氮菌） 葡萄糖 25 344~46 Mycobacterium tuberculosis（结核分枝杆菌）组合 37 792~93 Nitrobacter agilis（活跃硝化杆菌） 组合 27 1200 1）菌种，不同的微生物及微生物的不同菌株代时不同； 2）营养成分，在营养丰富的培养基中生长代时短，反之则长；

3）营养物浓度，在一定范围内，生长速率与营养物浓度呈正比 凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生长限制因子（growyh-limited factor）。

4）温度，在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关

相当于4000个地球的重量!!! 无限制对数生长的后果: 大肠杆菌一个细胞重约10 –12 克， 平均20分钟繁殖一代 24小时后： 4722366500万亿个后代，重量达到：4722吨 48小时后：2.2 × 10 43个后代，重量达到2.2 × 10 25 吨 相当于4000个地球的重量!!!

（三）稳定期（ stationary phase） 又称恒定期或最高生长期。这时的菌体产量达到了最高点。

①生长速率常数R等于0，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等； 1.特点: ①生长速率常数R等于0，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等； ②细胞开始贮存糖原、异染颗粒和脂肪等内含物； ③多数芽孢杆菌在这时开始形成芽孢； ④有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等次生代谢产物；

2.稳定期到来的原因 ① 营养物尤其是生长限制因子的耗尽； ② 营养物的比例失调，例如C／N比值不合适等； ③ 酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积； ④ pH、氧化还原势等理化条件越来越不适宜等。

3. 对生产实践的指导意义 以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物（SCP、乳酸等）为目的的某些发酵生产来说，稳定期是产物的最佳收获期； 对维生素、碱基、氨基酸等物质进行生物测定来说，稳定期是最佳测定时期； 通过对稳定期到来原因的研究，还促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建。

生产上 的措施 补充营养物质（补料） 取走代谢产物 调节pH 调节温度 对好氧菌增加通气、搅拌或振荡 可延长稳定生长期，以获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产物。

（四）衰亡期（ decline phase或death phase） 在衰亡期中，个体死亡的速度超过新生的速度，整个群体呈现负生长状态（R为负值）。

1.特点: 细胞形态发生多形化； 有的微生物因蛋白水解酶活力的增强而发生自溶（autolysis）； 有的微生物在这一期进一步合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢产物； 芽孢杆菌释放芽孢等。

2.产生衰亡期的原因 外界环境对继续生长越来越不利，Eg.营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累等，从而引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体死亡。 该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。

复习思考题 1. 中山大学2004年考研题 2.绘图说明细菌生长曲线，并说明其中每一时期有何特点及其在生产实践上的意义。（川大考研题）