第八章 工业发酵染菌的防治

第一节 工业发酵染菌的危害 纯种培养要求必须防止杂菌污染 为防止染菌，采取了一系列措施： 第一节 工业发酵染菌的危害 纯种培养要求必须防止杂菌污染 为防止染菌，采取了一系列措施： 密闭式发酵罐、无菌空气、无菌室、培养基和设备灭菌、无菌操作； 染菌无法彻底避免；据报道 国外抗生素发酵染菌率为2％~5%，国内抗生素发酵、青霉素发酵的染菌率为2％，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率为5%，谷氨酸噬菌体感染率为1％～2％ 染菌影响产率、质量、三废治理都有很大的影响。

一、 染菌对各种发酵的影响： 菌种、培养基、发酵条件、发酵周期以及产物性质不同，受污染的危害程度不同。 青霉素：产青霉素酶的杂菌 疫苗：全部废弃 柠檬酸：主要防止前期染菌 谷氨酸：噬菌体危害大 肌苷、肌苷酸：易染菌

二、染杂菌种类对发酵的影响 青霉素发酵污染细短产气杆菌比污染粗大杆菌危害大，链霉素发酵污染细短杆菌和假单孢杆菌和产气杆菌比污染粗大杆菌危害大，四环素怕污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌 三、不同染菌时期对发酵的影响： （1）种子培养期染菌：易染菌、应灭菌后除去，并对种子罐、管道进行检查和彻底灭菌。 （2）发酵前期染菌：易染菌、应特别防止，可重新灭菌，补充营养，重新接种发酵。

（3）发酵中期染菌： 发酵中期染菌，挽救处理困难，危害性大； 抗生素发酵： 将另一罐发酵正常、单位高的发酵液的一部分输入染菌罐中，以抑制杂菌繁殖，同时采取低通风，低流加糖量等措施

（4）发酵后期染菌 柠檬酸发酵： 污染细菌：加大通风量，加速产酸，降低pH，抑制细菌生长； 污染酵母 ：加0.025-0.035g/L硫酸铜； 污染黄曲霉；加入另一罐将近成熟的醪液，使pH下降，黄曲霉自溶 污染青霉：青霉能在低pH环境下生长，可考虑提前放罐。 （4）发酵后期染菌 可考虑提前放罐。

四、染菌程度对发酵的影响 染菌程度越大，即进入发酵罐的杂菌数目越多，对发酵的危害越大。 染少量杂菌，有时可以容忍； 前期和中期染菌，应结合染菌程度综合考虑。 五、染菌对产物提取和产品质量的影响 菌体自溶，发酵液发粘、发臭，过滤困难

第二节 染菌的检查、分析和防治 一、种子培养和发酵的异常现象 1、种子培养异常 （1）菌体生长缓慢：原料质量、菌体老化、供氧不足、温度、酸碱度，种子冷藏时间长或接种量过低。 （2）菌丝结团：菌丝团中央结实，内部菌丝的营养吸收和呼吸受到影响，不能正常生长。原因多而且复杂。 （3）代谢不正常：接种物质量和培养基质量、培养环境查，接种量小、杂菌污染等有关

2、发酵异常 （1）菌体生长差：种子质量的影响；导致代谢缓慢。 （2）pH不正常：培养基质量、灭菌效果、补糖等影响；是所有代谢反应的综合反映。 （3）溶解氧异常 染菌：染好氧菌，染厌氧菌

（4）泡沫过多 （5）菌体浓度过高或过低 泡沫的消长不符合规律；培养基灭菌时温度过高或时间过长，葡萄糖变成氨基糖会引起泡沫。 罐温长时间偏高；溶氧不足；营养条件差；种子质量差；菌体自溶。

二、染菌的检查与判断 1、染菌的检查 （1）显微镜检查法（最简单、最直接、最经常） （2）平板划线培养或斜面培养检查法； 平板制好后，应先保温24小时，确定无菌 （3）肉汤培养基检查法（酚红变色pH6.8-8.4）

2、以上3种检查法的不足 以上3种检查法未发现染菌，还不能肯定未被染菌； 原因是以上检查法只能检查杂菌浓度较大的染菌情况（>1个/ml）

3、发酵过程的异常现象来判断染菌 （1）溶解氧水平异常显示染菌（谷氨酸）

（2）排气中CO2异常显示染菌 CO2的含量变化是有规律的； 染菌引起糖的消耗变化，染好氧性杂菌，糖耗加快， CO2含量增加；染噬菌体，糖耗减慢， CO2含量减少。

三、发酵染菌率和染菌原因分析 （一）、发酵的染菌率 发酵染菌批数 总染菌率 ＝ ×100％ 总投料批数 染菌率与发酵的菌种、培养基、产品性质、发酵周期、生产环境条件设备和管理技术水平等有关。

（二）、染菌原因分析 （1）染菌原因分析就是总结染菌的教训，防范于未然。 （2）主要染菌原因：种子带菌，无菌空气带菌，设备渗漏，灭菌不彻底，操作管理不当。

（3）染菌的杂菌种类分析： 杂菌是耐热的芽孢杆菌（灭菌、死角） 杂菌是不耐热菌（种子带菌、空气带菌，设备渗漏，管理操作等） 杂菌是真菌（设备、冷却盘管的渗漏、无菌室灭菌不彻底或无菌操作不当，糖液灭菌不彻底）

（4）染菌的规模分析 大批量发酵罐染菌：种子、空气； 前期：种子带菌，灭菌问题； 部分发酵罐染菌： 个别发酵罐连续染菌：设备渗漏 中后期：空气带菌； 部分发酵罐染菌： 个别发酵罐连续染菌：设备渗漏

（5）染菌的时间分析 种子培养阶段：种子，灭菌，操作； 发酵前期：种子，灭菌，操作； 发酵后期：空气，补料，设备渗漏，泡沫

四、染菌途径及预防 1、种子带菌的防止 （1）培养基及用具灭菌要彻底，应防止假压； （2）菌种在转接过程中受污染：操作不当，管理不严；（缓冲间） （3）菌种在培养或保存过程中受污染（试管塞，查看的时候要注意） 2、无菌空气带菌及其防止： 流程设计，介质灭菌

3、培养基和设备灭菌不彻底导致染菌及防治 （1）原料性状：淀粉质原料，升温过快或混合不均匀，易结块，团块中包埋的活菌不易杀灭；可升温前搅拌和加淀粉酶。 （2）实罐灭菌时未充分排除罐内空气：造成假压，升温时，应打开排气等阀门放气。

（3）连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底。 （4）设备和管道存在“死角” 死角：由于操作、设备结构、安装或人为造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到达或不能充分到达预定应该到达的局部灭菌部位，从而不能达到彻底灭菌的要求。

常见的设备、管道“死角” 发酵罐的“死角”：不锈钢衬里破裂造成死角，发酵罐罐底脓疱状积垢。

管道安装不当形成的死角

4、设备渗漏引起的染菌及其防止 （1）发酵设备、管道、阀门长期使用，由于腐蚀、摩擦和振动等原因，造成渗漏。 （2）微小渗漏的检查：加入碱性水，用浸湿酚酞 指示剂的白布擦，有渗漏则白布显红色。

5、操作失误导致染菌及其防治 （1）灭菌过程中严防泡沫升顶，尽可能添加消泡剂防止泡沫大量产生； （2）传感器探头用化学试剂浸泡法灭菌可能导致灭菌不彻底。

抗生素染菌实例分析 1、现象： 一级种子罐连续染菌，菌型一致，均为芽孢杆菌，接种后24小时就当班片子种发现，量相当大。5批染3－4批。罐内无搅拌，夹套降温。

2、分析：母瓶无菌斜面正常，不接种的白料无菌试验罐也染菌（种子原因排除），消后无菌斜面正常，接种后12小时左右的斜面能镜检出杂菌（操作原因基本排除）。罐体内只有一取样管和一空气管，较干净，蒸汽压力和仪表温度对应良好，消毒工都有十几年的工作经验，操作问题不大（为了排除操作问题，我和技术员和消毒工共同消了几个罐，无菌仍不正常）。 判断有罐体内可能有料垢和死角。

3、结论： 根据我在生产中碰到和解决的无菌问题来看，靠罐阀的检修不到位造成的染菌站15％左右，包括密封垫脱落、老化，阀头脱落，外漏，内漏等等，作大生产，要不有钱买好设备，要没钱必须要有好的制度和好的操作工。根据我的生产经验看，买好设备要划算的多，染一罐少则损失几百元，多则几十万。

6、噬菌体污染和防治 （1）、噬菌体污染的预防 ① 严格活菌体排放，切断噬菌体的粮源 ②做好环境卫生，消灭噬菌体与杂菌 ③ 严防噬菌体与杂菌进入种子罐或发酵罐内 ④抑制罐内噬菌体的生长

（2）、污染噬菌体后的处理方法 ①并罐法 ②转换使用菌种或使用抗性菌株 ③放罐重消法 ④罐内灭噬菌体的方法 ⑤添加噬菌体抑制剂的方法

五、染菌的挽救与处理 1、种子培养期染菌的处理 灭菌、重新制种、倒种 2、发酵前期染菌的处理 3、发酵中后期染菌的处理 废液应加热至120℃，保持30min才能放罐 4、染菌后对设备的处理 重新使用前，应彻底清洗，空罐灭菌

作业： 1、不同染菌时期对发酵有何影响。 2、试从染菌途径分析染菌的可能原因有哪些。