Inactivation of EWS reduces PGC-1α protein stability and mitochondrial homeostasis Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 May 12;112(19):6074-9. 报告人：王旭丹 IF： 9.674 PMID: 25918410

一 背景 EWSR1（ ewing sarcoma breakpoint region 1，基因断裂区）属于ETS（ E-twenty six ） family， ETS家族蛋白都有一个高度保守的DNA结合结构域，即ETS结构域，可以结合有GGA(A/T)序列的DNA结合位点。 ETS涉及细胞分化的调控，细胞周期的调控，细胞迁移，细胞增殖，细胞凋亡，血管生成等。许多ETS都被证实与癌症有关，如通过基因的融合。如ERG(ETS Related Gene)转录因子与EWS基因融合后，就会导致尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma). EWS(Ewing sarcoma protein)是一种RNA和ssDNA结合蛋白，也是一种转录因子，可以结合并调节转录辅因子，与基因的选择性拼接有关。

一 背景 B淋巴细胞的生长 减数分裂 有丝分裂 预防纤维母细胞和造血干细胞衰老 决定胚胎棕色脂肪的分化 Recently EWS

一 背景 PGC-1α PGC-1α是一种转录因子，在脑、心、骨骼肌中高表达，其生物功能的实现与有氧代谢有密切的关系。 激素 营养物质 环境 物理因素 PGC-1α 线粒体发生 脂肪酸β氧化 糖异生 血红素生物合成 转录水平/转录后水平调节 蛋白本身不稳定，容易被泛素蛋白酶通路分解 E3 连接酶FBXW7可以结合并泛素化 PGC-1α，调节PGC-1α转录和蛋白水平稳定性，使PGC-1α快速累积并激活，以对抗环境和营养物的改变。

二 材料和方法 Cell lines: Mouse brown preadipocytes(棕色脂肪前体细胞), C2C12 myoblasts(分化快，形成肌小管和肌肉蛋白), primary myoblasts(原代成肌细胞) and HEK293-FLAG-PGC-1α(HEK293细胞系来源于人胚胎肾脏组织；Flag标记PGC-1α转染HEK293细胞) Animal: newborn Ews−/− (EWS-KO) mice, 同基因小鼠C57BL6 Methods: Histological Analysis，Transmission Electron Microscopy（透射电子显微镜法），Western Blot，Plasmid tranfection， Mitochondria DNA Quantitation and Functional Analyses，Flow Cytometry Analysis，Fatty Acid β-Oxidation Analysis，qRT-PCR. NADH脱氢酶亚基1/核编码β-actin(mtND1/β-actin), 细胞色素c氧化酶亚基2/β-globin(Cox2/β-globin)

三 结果 棕色脂肪：负责分解引发肥胖的白色脂肪，将其转化成二氧化碳、水和热量。仅在人类婴儿时期发挥作用。 1 Loss of Ews in BAT Reduces Mitochondria Abundance and Structural Anomalies. EWS-/-:线粒体数量少，嵴稀疏。有较多的胞质小泡，胞质小泡中有残余物和没有或者少量分解的嵴。

三 结果 2 Ews Inactivation Reduces Mitochondrial Density and Function. 在EWS-KO棕色脂肪前体 细胞中，线粒体DNA 水平下降。 蓝色染DNA,红色染 有活性的线粒体。 DNA减少，膜上有活性 的线粒体减少，降低 线粒体膜电位。 C2C12 myoblasts

三 结果 Cox7a, COX8b与线粒体呼吸作用有关，Tfam与DNA 复制有关。 Oligomycin，寡霉素，干扰ATP的生成。 FCCP，Mitochondrial oxidative phosphorylation inhibitor，干预ATP合成. 线粒体基因表达下降，延胡索酸盐浓度下降。 线粒体呼吸泄露增加，线粒体最大呼吸能力降低。

三 结果 3 EWS Inactivation Reduces PGC-1α Protein Levels iBAT 棕色脂肪前体细胞

三 结果 3个抗体： 鼠源单抗（4C1.3），识别113kDa(PGC-1α的N端)。 兔源多抗，识别82-90kDa (一个结合PGC-1α蛋白多肽链的前300个氨基酸，H-300） (另一个结合PGC-1α蛋白C端)

三 结果 放线菌酮追踪实验检测PGC-1α半衰期。 EWS-/-时，在放线菌酮干预2h时，PGC-1α急速下降。 蛋白酶抑制剂MG132干预， 防止PGC-1α蛋白水解。 PGC-1α快速降解与蛋白酶体通路有关。

三 结果 4 Increased Ubiquitination and Degradation of PGC-1α in the Absence of EWS. EWS-/-增加PGC-1α泛素化， EWS和PGC-1α 有比较微弱的相互作用。 C2C12 myoblasts， primary mouse myoblasts

三 结果 5 Complementation of EWS Restores PGC-1α Protein Levels and Mitochondria Abundance. EWS-/-细胞中再加入GFP标记的EWS， 可以逆转PGC-1α的水平和线粒体丰度。 EWS-/-细胞中加入GFP标记的PGC-1α ， 也同样可以逆转PGC-1α的水平和线粒体丰度。

三 结果 EWS-/-细胞中再加入GFP标记的 EWS和PGC-1α ， 可以恢复线粒体膜电位。

三 结果 6 FBXW7 E3 Ligase Is Involved in Degradation of PGC-1α in EWS-KO Cells. EWS-/-细胞中Fbxw7高表达。 Fbxw7敲减增加PGC-1α的表达和线粒体丰度。

三 结果 Fbxw7敲减增加线粒体膜电位。 Fbxw7敲减降低PGC-1α 的泛素化。 (附件) EWS-/-细胞中Fbxw7-PGC-1α 再加入GFP-EWS, Fbxw7-PGC-1α 相互作用降低。 Fbxw7与EWS-/-细胞中快速降低的PGC-1α 水平和线粒体丰度有关。

三 结果 7 Inactivation of Ews Reduces Mitochondrial Activity in Skeletal Muscle. TA:tibialis anterior muscle胫骨前端肌肉。 EWS-/-小鼠TA线粒体丰度减少。 EWS-/-小鼠TA线粒体细胞色素c氧化酶和琥珀酸脱氢酶降低。 9-12周岁

三 结果 slow fiber-specific gene fast fiber-specific gene EWS-/-小鼠的股四头肌中线粒体ATP酶活性下降，COX和SDH也下降（附件）。 EWS-/-降低慢肌纤维特异基因，对快肌纤维特异基因没有显著作用。

三 结果 8 Reduced Hepatic Expression of Essential Mitochondrial Genes and Elevated Serum Lactate Levels in EWS-KO Mice. EWS-KO降低与线粒体呼吸作用(ATP5o, COX5b),线粒体生成(ERRα) 和脂肪酸氧化酶相关基因(LCAD, SCAD and VLCAD) 的水平。 EWS-KO也降低糖异生相关基因(G6P and PEPCK)，但不明显。

三 结果 EWS-KO降低脂肪前体细胞中 油酸分解为CO2，降低酸性可溶物质。 EWS-KO增加血清乳酸盐的含量，这与PGC-1α 降低有密切关系。

三 结果 EWS-/- iBAT liver 2 3 4 1 7 8 5 5 6 skeletal muscle E3 连接酶 线粒体丰度 和结构异常 HEK293-FLAG-PGC-1α PGC-1α PGC-1α泛素化和降解 棕色脂肪 前体细胞 线粒体密度 和功能 skeletal  muscle 线粒体活性 liver 线粒体基因 血清乳酸盐 2 3 4 1 7 8 5 修复 5 修复 6 EWS-/-中 再加入EWS FBXW7 E3 连接酶 EWS-/-中 再加入EWS

四 讨论 EWS属于FET family,是一种RNA结合蛋白，其基因可以重排多种转录因子。EWS失活可降低其辅因子PGC-1α的水平，降低线粒体丰度和功能。这一现象在棕色脂肪前体细胞、成肌细胞、骨骼肌和肝脏中证实。FUS突变可以诱发肌萎缩性侧束硬化症（ALS）,在ALS病人和动物模型中，出现线粒体损伤和功能紊乱。 FUS突变也可以导致小鼠驱动神经元中线粒体缩短。 PGC-1α失活降低线粒体密度和功能，降低棕色脂肪的非耦合呼吸作用和产热，降低骨骼肌氧化和收缩能力，与肝脏糖异生和脂肪生成无关。 EWS 缺失可以提高FBXW7和PGC-1α的相互作用，进一步增加PGC-1α降解。但EWS 调节FBXW7的机制还需进一步研究。

四 讨论 虽然EWS和PGC-1α的结合比较微弱，但是考虑到这种相互作用存在于细胞器水平，所以EWS可能直接保护PGC-1α。另外，这种相互作用可能通过改变PGC-1α转录后修饰（磷酸化或者乙酰化）而改变PGC-1α稳定性。 EWS22号染色体易位，导致EWS染色体单倍型不足，可能是引起PGC-1α、线粒体密度和降低潜在原因。 一般癌细胞供能利用糖酵解过程，而不是线粒体呼吸（ Warburg effect）。因此EWS染色体单倍型不足可能对Warburg effect有影响。？引出 癌细胞中PGC-1α、线粒体密度和功能与EWS染色体易位的研究。