植物组织与器官培养 植物组织培养：在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、胚胎、原生质体等培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽，或者长成新的完整植株的一种实验技术。 植物器官培养：将植株上的各种器官从母体上分离出来，放在无菌的人工环境中让其进一步发育，最终长成幼苗的过程。

植物离体无性繁殖 简称离体繁殖（in vitro propagation)、微型繁殖（micropropagation)，是指利用离体培养技术将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，并在短期内获得大量遗传性一致的个体的方法（技术）。 用这种方法得到的植株群体来自一个单株（或一个单芽），它们遗传组成相同，这些株群可称单株无性系。 近400种植物离体繁殖已获成功。兰花、无子西瓜、马铃薯、杨树等已在种苗生产上广泛应用。

植物离体无性繁殖的意义（优越性） 繁殖速度快，经济效益高 占用空间小，不受季节限制， 便于工厂化育苗 离体繁殖周期：1～3个月 繁殖系数：几十～几百倍 又称快繁 繁殖速度快，经济效益高 占用空间小，不受季节限制， 便于工厂化育苗 离体繁殖是建立在体细胞系的基础上，是在人工控制的环境条件下，不会造成性状分离，也不会退化，同时还可避免病虫害的侵染。 繁殖各种珍稀、涉危苗木和突变体，为育种服务

手指玫瑰

植物离体无性繁殖的方式 器官发生型(organogenesis type) 胚状体发生型(embryogenesis type) 不定芽型（adventitious bud type) 器官型(organ type) 原球茎型(protocorm type) 球茎芽型 块茎型 鳞茎型 孢子型 根茎型 微枝扦插型

器官发生型(organogenesis type)： 诱导器官外植体产生愈伤组织，经分化培养形成芽、根再生成植株的方式。 技术关键：外植体诱导产生的愈伤组织要早期挑选，使其来源尽量一致。 特点：繁殖速度快；培养经愈伤组织阶段再生成植株，遗传性不稳定，易产生变异。 芦荟、烟草、油菜等

基本程序与技术 无菌母株制备 增殖、分化 植株再生及鉴定 炼苗和移植 材料灭菌 无菌母株制备 培养基筛选 培养基中激素配比 增殖、分化 激素种类及浓度 植株再生及鉴定 基本培养基组成 渗透压 炼苗和移植 逐步过渡

芦荟组织培养快速繁殖 材料和培养基 10～15cm高的芦荟幼苗 愈伤组织诱导培养基 分化培养基 生根培养基 MS＋(1-6mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA 分化培养基 MS＋(2-4mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA 生根培养基 MS＋(0.1-0.5mg/L)IBA+(2-5mg/L)多效唑 多效唑是一种起着延缓细胞生长、抑制顶芽、促进侧芽的化学调控物质。

繁殖方法 愈伤组织培养 外植体：茎尖 外植体消毒：酒精＋升汞 培养基：愈伤组织诱导培养基 培养条件：温度 25±2℃ 光照 1000~2000lx 10~12h/d 培养时间 15～25d （形成愈伤）

繁殖方法 继代培养 分化培养 种子 愈伤切块 培养基及条件 同愈伤组织培养 培养时间 10～30 培养基 分化培养基 培养条件 同愈伤组织培养 培养时间 30～50d （出芽，叶）

生根培养 炼苗 移栽 材料 3cm高的幼苗 培养基 生根培养基 培养条件 同愈伤培养 培养时间 >15d 选材 苗高5～10cm，健壮 培养基 生根培养基 培养条件 同愈伤培养 培养时间 >15d 炼苗 选材 苗高5～10cm，健壮 清洗培养基，喷水 条件 15 ℃～25℃，60％～80％湿度，12～24h 移栽 移入驯化苗圃（蛭石组成） 15～20d 移入苗圃

胚状体发生型(embryogenesis type)： 指植物器官、组织和细胞外植体经培养脱分化形成胚状体再成苗的方式。 技术关键：提高不同外植体胚状体发生及萌发率和提高胚状体同步化率。 特点：胚状体发生数量多、速度快、结构完整，繁殖系数高；遗传性稳定。 甘蔗、胡萝卜、石刁柏等

不定芽型（adventitious bud type)： FLash 选取具有顶芽和腋芽的短枝无菌培养，诱导芽萌发成苗或增殖产生许多不定芽发育成苗，将新萌生的枝条再转接继代，重复芽到苗的增殖过程，最后使其生根形成植株的方式。 技术关键：打破顶端优势，促使腋芽增殖并促其生根。 特点：繁殖率高、保持物种的遗传稳定性，多用于林木的繁殖。

器官型(organ type) 指直接从茎、叶、鳞片等外植体上诱导不定芽或带芽的休眠器官（如小鳞茎、小球茎、小块茎）产生再生成植株的方式。 技术关键：对培养基要求高，控制好激素浓度，避免愈伤组织发生。 优点：繁殖率高，速度较快；遗传性稳定。 三倍体无籽西瓜、甘蔗、香蕉、香石竹、丝石竹等

原球茎型(protocorm type) 兰属特有的方式，即外植体经培养产生原球茎，再直接长成植株。

球茎芽型 叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根 遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植 唐 观 菖 叶 蒲 海 棠 球茎芽型 观叶海棠 球茎芽型 叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根 遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植 观叶海棠 球茎芽型 叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根 遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植 观叶海棠 球茎芽型 叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根 遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植 观叶海棠 球茎芽型 叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根 遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植 观叶海棠 球茎芽型 叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根 遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植 观叶海棠 球茎芽型 叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根 遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植 观叶海棠 球茎芽型 叶柄表面产生圆球形小突起——球茎芽，一端出芽一端出根 遗传性较稳定，球茎芽可直接放入土中种植 唐 菖 蒲 观 叶 海 棠

块茎型 叶片或叶柄上形成粒状芋块，进一步分化出芽和根 块茎芽可为繁殖系母体，不断切割繁殖移栽，成活率高 。 花叶芋

鳞茎型 鳞片近轴面或边缘直接形成带根的小鳞茎 在试管内形成小鳞茎需较长时间 百合 郁金香

孢子型 用成熟或未成熟的孢子进行培养 孢子繁殖最困难的是表面消毒，萌发时间较长 地钱 狼尾蕨

根茎型 蕨类具有横向的茎及直立的短根茎，为组织培养的最佳外植体 根状茎上产生蕨叶及根，繁殖速度较孢子型快 肾蕨等

微枝扦插型 带芽的小插条在试管内进行无菌扦插 为木本植物进行快速繁殖的主要方式 葡萄、杨树

植物离体培养脱毒技术 病毒在植物体内的分布及危害 植物脱病毒方法 脱毒植物检测及保存

病毒的特性及其对植物的危害 大多数植物病毒不经种子传播； 无性繁殖的植物，都易受到一种或多种病毒的侵染。 植物种类 染病毒种类 菊花 康乃馨 水仙 月季 葡萄 无花果 19 11 4 10 26 5 矮牵牛 马铃薯 大蒜 苹果 草莓 桃 17 24 36 23

苹果锈果病 薄荷病毒病病

郁金香杂色花 郁金香正常花

病毒在植物体内的分布 病毒在植物体内的分布具有不均匀性，随植株不同部位和年龄而异。 老叶和成熟组织及器官中病毒含量较高 根尖、茎尖生长点约0.1~1mm区域内，几乎不含病毒。 （原因？） （原因：分生组织细胞分裂和生长速度快，而病毒在植物体细胞内繁殖速度相对较慢；另外，病毒是通过筛管组织或胞间联丝传播至其他组织细胞的，而茎尖分生组织无分化，没有维管组织。）

病毒在植物体内的分布具有不均匀性的理论假说 (1) 能量竞争 病毒核酸和植物细胞分裂时DNA合成均需要消耗大量的能量，而分生组织细胞本身很活跃，其DNA合成是自我提供能量自我复制，而病毒核酸的合成要靠植物提供能量来自我复制，因而就得不到足够的能量，从而就抑制了病毒核酸的复制。 (2) 传导抑制 病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在分生组织中，维管组织还不健全，从而抑制了病毒向分生组织的传导。

(3) 激素抑制 在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均很高，因而阻滞了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。 (4) 酶缺乏 1969年，Stace-Smith提出，可能病毒的合成需要的酶系统在分生组织中缺乏或还没建立，因而病毒无法在分生组织中复制。 (5) 抑制因子 1976年，Martin-Tanguy等提出了抑制因子假说，认为在分生组织中存在有某种抑制因子。

热处理脱毒法 原理 ①热处理不能杀死病毒，只能钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或停止，而失去侵染能力； ②作为一种物理效应可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。

热处理脱毒法 愈伤组织热处理法 从患病植株上取叶片（茎片、鳞片、花器等）进行离体培养，诱导形成愈伤组织，然后将愈伤组织反复继代培养同时兼用热处理。 常用的温度及处理时间 37℃ ~ 38℃（2、4或8周） 50℃（3~15min)

热空气处理脱毒法 将试验母株在高温生长室中生长一个阶段，使其顶端分生组织和次生分生组织迅速生长，然后切取其茎尖分生组织进行离体培养。 生长室温度（35℃ ~40℃） 光照强度（3000~10000Lx)

愈伤组织继代兼热处理钝化TMV和CMV获得烟草无病毒植株的效果 次数 25℃ 30℃ 37℃ 25℃ 30℃ 37℃ 0 0/20 — — 8/21 -- -- 1 0/20 0/20 0/20 5/18 4/19 10/21 2 0/20 0/20 0/20 8/20 10/20 11/20 3 0/20 0/20 8/20 10/20 8/20 11/20 4 0/20 0/20 5/20 5 4/20 1/20 5/20 结论: 病毒种类不同,愈伤组织反复继代兼热处理的效果不同；TMV、CMV均经37℃热处理，脱毒效果最好。

其它效果 香石竹（康乃馨）在38℃～40℃下经两个月处理可除去全部病毒。

马铃薯在37℃下处理10～20天能除去卷叶病毒。

热处理脱毒法 优点 缺点 方法简单，效果明显。 ①具有局限性，不能去除所有病毒。只对圆形病毒（苹果花叶病毒），或对线状病毒（马铃薯卷叶病毒）有效；而对杆状病毒（千日红病毒）无效。 ②极易使植物材料受热枯死，造成损失

茎尖培养脱毒法 依据 原理

康乃馨不同大小茎尖与康乃馨斑驳病毒的脱毒效果 茎尖大小(mm) 培养数 荆芥鉴定之病斑 总病斑 接种叶数 平均病斑数/叶 无病毒茎尖 数目 % 0.1 0.25 0.5 0.75 1.0 >1.0 3 20 30 9 4 5 3 13 0.2 137 61 2.2 1198 70 17.1 429 12 35.3 432 11 39.2 1972 20 98.6 2 66 8 40 4 13 1 11 0 0

影响茎尖培养法脱除植物病毒的因素 母体材料病毒侵染的程度 外植体的生理状态 起始培养的茎尖大小 茎尖培养法脱除植物病毒的技术关键 茎尖越小对培养基的要求越高，成功率越低。

微体嫁接法(micrografting) 应用微体嫁接的原因： 木本植物茎尖培养难以生根形成植株。 具体做法： 将极小的茎尖（0.14mm~1.0mm）作为接穗嫁接到不带病毒的种子实生苗砧木上，然后将砧木、接穗一起在培养基上培养。 优点： 接穗在砧木上易成活，故可用很小的茎尖来培养，去除病毒几率大，获得无病毒苗的可能性大。

苹果茎陷病毒的茎尖培养脱毒 接穗： <0.2mm茎尖 砧木：无菌实生苗的胚轴（带两片子叶） 方法：劈接法将接穗插入两片子叶之间的组织中

微体嫁接法(micrografting) 脱除病毒的关键： ①要求剥离技术很高 ②需要考虑砧木和接穗对营养组成的不同要求； ③与接穗的取材季节有密切关系（苹果4~6月取材嫁接成活率较高。）

珠心组织培养脱毒法 依据： 病毒通过维管组织传播，而珠心组织（孢子体部分）与维管组织没有直接联系，故可以通过珠心组织培养获得无病毒植株。 目前已用该方法去除了柑橘银屑病、叶脉突出病、柑橘裂皮病、速衰病等病毒。 该方法的缺点： 存在20%~30%左右的变异率，无病毒苗苗期较长。柑橘要6~8年才能结果。

胚珠

愈伤组织培养脱毒法 通过植物器官或组织诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再诱导分化芽，长成植株，可以获得脱毒苗，这在天竺葵、马铃薯、大蒜、草莓、枸杞等植物上已先后获得成功。利用诱导各器官愈伤组织培育无病毒苗的机制，可能有如下几种： （a）病毒在植株体内不同器官或组织分布不均 （b）病毒复制能力衰退或丢失； （c）继代培养的愈伤组织抗性变异。

几种马铃薯病毒病的症状

血清鉴定法(serologic test) 实验依据：沉淀反应 植物病毒“抗血清”在植物病毒诊断中优点： 病毒抗血清具有高度专化性： ①专一性；②“预见性”；③定量性。 病毒抗血清在诊断上的局限性： 不是所有病毒都能制成抗血清 能够提纯的病毒量太少，或在提纯过程中丧失了必备的抗原结构； 植物体内的单宁物质使病毒丧失了抗原性质。

血清鉴定法 基本方法： 玻璃片凝集法 （平皿）微量凝集试验 试管沉淀反应 免疫双扩散 ELISA 带该种病毒 病毒感染 人工注射异体蛋白 玻璃片凝集法 （平皿）微量凝集试验 试管沉淀反应 免疫双扩散 ELISA 带该种病毒 病毒感染 动物 动物 植物 + 人工注射异体蛋白 免疫球蛋白 血清反应 （抗原） （抗体） （抗原）

生物鉴定法（指示植物鉴定） 依据： 指示植物： 对环境中的一个因素或各因素的综合条件具有指示作用的植物种 优点： 指示植物对病毒极为敏感，一旦感染病毒就会在叶片或全株上表现出特有的病斑。 指示植物： 对环境中的一个因素或各因素的综合条件具有指示作用的植物种 指示植物分类： ①接种后产生的症状可扩散到非接种部位。 ②只在接种部位产生明显病斑。 优点： 操作方便，条件简单，经济有效；还可以根据病毒的寄生范围，确定几种指示植物，准确性强。 有些植物对病毒极为敏感，一旦感染病毒就会在叶片或全株上表现出特有的病斑，把这种植物称为指示植物或病毒敏感植物

生物鉴定法 接种方法 ①摩擦接种法 取待检查植株叶片，经处理后用其汁液和金刚砂混合，轻轻摩擦指示植物叶片，使汁液能侵入叶片表皮细胞但又后，观察指示植物有无病毒感染症状。 马铃薯X病毒侵染千日红（叶片呈枯斑） 马铃薯M病毒侵染千日红（叶片呈突起枯斑）

②嫁接法 一些木本多年生果树或草莓等无性繁殖草本植物，其病毒不是通过汁液而是其他介体传播[如草莓黄化病毒是由蚜虫（Mtzus fragaefolii）传播的，这种病毒鉴定可采用嫁接法，即用鉴定植株芽作接穗，指示植物作砧木。根据指示植物的表现判断是否脱除了病毒。

电镜检查法 直接观察，检查是否有病毒颗粒。 优点：准确，有效 不足：需要一定的设备和技术（超薄切片技术、背景染色法、扫描电镜使用）。

分子检测法 优点：快速、简便、灵敏度高和特异性强。 常用的方法 聚合酶链式反应（PCR） 双链RNA分析技术 核酸分子杂交和序列分析技术 RFLP、RAPD等分子标记技术

无病毒原种的保存与繁殖 无病毒原种的保存 可利用隔离法进行保存。 无病毒原种的繁殖 建立一套严格的良种繁育制度，生产场所做好土壤消毒和防昆虫工作，保持无病毒原种材料质量。

脱毒苗保存

花药及花粉培养 概念及意义 花药培养属于 器官培养范畴 花粉培养属于 细胞培养范畴 也称小孢子培养

花药培养：把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上，使其发育和分化成植株的过程 花粉培养：从花药中分离出花粉粒使之成为分散或游离的状态，通过培养使其脱分化并发育成植株的过程 目的是获得单倍体植株 迅速获得纯合型材料，缩短育种年限 获得育种中间材料 与诱变育种相结合可以提高诱变频率 与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义 作为遗传工程受体更为有效 用作基础遗传研究的各个领域

花药培养的基本程序是 Flash 花药培养技术特点：选处于生殖生长高峰期的花药，需低温预处理（3～10℃，2～10天），光照先弱后强。 低温处理的作用： 可以激发花粉母细胞产生两个相等核，二不是一个营养核一个生殖核。 保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老。 激发花粉产生原胚。 促使细胞同步分裂。 在烟草中，只有原来贴靠着花药壁的花粉粒才能顺利发育成花粉胚。在天仙子中，也只有处在药室外围紧靠绒毡层的花粉才能够发育成花粉胚。－－药壁因子作用－Sunderland(1978)

花粉或小孢子培养 花粉或小孢子的分离

培养方法 花药看护培养 花粉悬浮培养 固液双层培养

植物胚胎培养 Flash

小结 植物脱毒快繁是无性植物种苗生产最有效的技术。 外植体选择是植物组织培养的基本环节，应根据不同培养目的确定取材原则。

思考题 1．利用茎尖分生组织培养脱除去植物病毒的原理。 2．哪些因素会影响茎尖培养的脱毒效果？ 3. 如何检测脱毒效果？ 4．微繁殖中芽的增殖方式有哪些？ 5．为什么用于繁殖的组培技术要尽量避免使用外源激素？ 6．通过离体培养获得单倍体的途径有哪些？ 7. 基本概念