第一章 植物组织培养的发展简史.

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1 第一章 植物组织培养的发展简史

2 1904年Hannig在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和辣根菜的胚，并使这些胚在离体条件下长到成熟。
一、 探索阶段(20世纪初至20世纪30年代中) 20世纪初，德国植物生理学家Haberlandt提出了高等植物的器官和组织可不断分割，直至分到单个细胞的观点，并设想离体细胞具有再生完整植株的潜力。 1904年Hannig在无机盐和蔗糖溶液中培养了萝卜和辣根菜的胚，并使这些胚在离体条件下长到成熟。 Laibach(1925，1929)把由亚麻种间杂交形成的不能成活的胚剖出，在人工培养基上培养至成熟，从而证明了胚培养在植物远缘杂交中利用的可能性； 1922年，美国的Robbins和德国的Kotte分别报道培养离体根尖获得某些成功。 1934年，White成功离体培养了番茄的根尖。

3 二、 奠基阶段(20世纪30年代中至50年代末) 1、White (1937)用3种B族维生素（吡哆醇、硫胺素和烟酸），取代酵母浸出液获得成功。认识了B族维生素对植物生长的重要意义。 2、Gautheret(1934)在山毛柳等形成层组织的培养中发现，只有在培养基中加入了B族维生素和IAA以后，形成层组织的生长才能显著增加。1939年Gautheret连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。同年，White由烟草种间杂种的瘤组织，Nobecourt由胡萝卜，也建立了类似的连续生长的组织培养物。因此，Gautheret、White和Nobecourt一起被誉为植物组织培养的奠基人。

4 3、Skoog(1944)以及Skoog和崔澂(1951)发现，腺嘌呤或腺苷可以促进愈伤组织的生长，还能解除培养基中生长素对芽形成的抑制作用，诱导芽的形成，确定了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。 4、1952年，Morel和Martin首次证实，通过茎尖离体培养，可以由已受病毒侵染的大丽花中获得无病毒植株。 5、 年，Muir把烟草的愈伤组织转移到液体培养基中，放在摇床上振荡，形成了由单细胞和细胞聚集体组成的细胞悬浮液。Muir等还用机械方法由细胞悬浮液和容易散碎的愈伤组织中分离得到单细胞，把它们置于一张铺在愈伤组织上面的滤纸上培养，使细胞发生了分裂。 6、1955年，Miller等由鲱鱼精子DNA中分离出一种首次为人所知的细胞分裂素，并把它定名为激动素(kinetin)。

5 7、1957年，Skoog和Miller提出了植物激素控制器官形成的概念，指出在烟草髓组织培养中，根和茎的分化是生长素对细胞分裂素比率的函数。
8、1958年，Steward等以胡萝卜为材料，首次通过实验证实了Haberlandt关于细胞全能性的设想，成为了植物组织培养研究历史中的一个里程碑。 9、 年，Reinert和Steward分别报道，在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚。

6 三、迅速发展阶段(20世纪60年代至现在) 1、基础研究： 1965年，Vasil和Hildebrandt用一种化学成分确定的培养基，由分隔培养的烟草单细胞获得了完整的再生植株，进一步证实了植物细胞的全能性 。  由一个单细胞再生完整植株

7 2、原生质体培养取得重大突破： 1960年Cocking等用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功。
1971年，Takebe等首次获得了烟草原生质体再生植株。 1972年，Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种。

8 3、花药培养取得显著成绩 1964年，Guha和Maheshwari报道，在毛曼陀罗中通过离体花药培养由小孢子直接发育成胚。 1967年，Bourgin和Nitsch通过花药培养获得了完整的烟草植株。

9 4、微繁技术得到广泛应用 1960年，Morel建立了一个离体无性繁殖兰花的方法，繁殖系数极高。由于这一方法有巨大的实用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起“兰花工业” 。

10 第十一届国际植物组织培养和生物技术大会 （北京， ）

11 全国植物生物技术大会 广州市，2007，11，11

12 全国植物生物技术大会 福州市，2011，11，18

13 第二章 植物组织培养的应用

14 植物组织培养可应用于以下几个方面 ： 1．挽救濒于灭绝的植物； 2．快速繁殖稀有植物或有较大经济价值的植物； 3、生产脱毒苗；

15 4、利用组织培养的材料作为植物生物反应器；生产某些蛋白质、氨基酸、抗生素、疫苗、代谢产物等。
5、组织培养结合超低温可经济有效地保存植物种质资源

16 6、组织培养是转基因技术不可或缺的组成部分；
7、作物育种 （1）单倍体育种：假定两个杂交亲本在n个独立遗传的位点上彼此不同，通过花药培养，在理论上只要有2n个F1代花粉植株，就有可能得到一个所需要的基因组合，而传统育种方法，则至少要有4n个F1植株才能得到一个所需要的基因组合。 （2）在远缘杂交中，通过离体授粉或原生质体融合有可能克服受精前障碍，通过幼龄合子胚培养可以克服受精后障碍，通过体细胞融合还有可能制造出细胞质杂种。

17 （3）通过细胞培养，在细胞水平上进行突变体选择，可在一定程度上使高等植物的育种程序微生物化，从而提高选择效率，节省时间和土地面积。
（4）体细胞无性系变异是除有性杂交和理化诱变之外的第三个变异来源。

18 8、用人工种皮包被体细胞胚制造人工种子，为稀有和珍贵物种的繁殖提供了一种高效的手段。
9、用于遗传学、分子生物学、细胞生物学、胚胎学、基因工程、植物发育等的基础研究。 离体培养大岩桐花萼直接形成花芽 试管兰花开花

19 10、试管花卉

20 第三章 植物组织培养有关的基本概念

21 一、植物细胞全能性(totipotency)
细胞全能性:指一个活的植物细胞，只要有完整的膜系统和细胞核，它就会有一整套发育成一个完整植株的遗传基础，在一个适当的条件下可以通过分裂、分化再生成一个完整植株。 理论上讲，只要是一个活的细胞，都有再生出一个完整植株的潜力，但实际情况并非如此简单。就目前所知，细胞的再生潜力与其分化程度呈负相关，就是说细胞分化程度越高其再生能力越低，所以应尽量选取幼嫩的植物组织作为培养的实验材料。

22 二、细胞分化、脱分化与再分化 细胞分化——分生性细胞在形态结构和功能上发生永久性(不可逆转性)适度变化的过程。
脱分化——由失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成无分化的细胞团（即愈伤组织,callus）的过程。 胡萝卜下胚轴脱分化形成的愈伤组织 胡萝卜下胚轴的脱分化

23 三、器官发生 再分化——由无分化的愈伤组织细胞再转变成为具有一定结构，执行一定生理功能的细胞团和组织，构成一个完整的植物体或植物器官的过程。
大岩桐叶片愈伤组织上分化出叶芽 三、器官发生 由愈伤组织的部分细胞先分化产生芽(或根)，再在另一种培养基上产生根(或芽)，形成一个完整植株。

24 第四章 植物组织培养所需的设备与条件

25 1、化学药品室；2、培养基配制室；3、灭菌室；4、接种室；5、培养室；6、培养物的检测和观察记录室。
植物组织培养室应包括： 1、化学药品室；2、培养基配制室；3、灭菌室；4、接种室；5、培养室；6、培养物的检测和观察记录室。 一、化学药品室 应配置几个药品橱、实验台、万分之一和百分之一的电子天平。室内还应放一台大容量的冰箱，用来分门别类地保存激素、抗生素和各种需低温保存的物品。

26 组织培养所需主要药品的存放要求如下： 1、可室温存放的药品：无机物、蔗糖、 盐酸、氢氧化钠， 95％酒精，琼脂。 2、宜于零上低温存放的化学药品: 有机物、激素 3、应当在一20℃下保存的药品： 液体抗生素等。

27 二、培养基配制室 需要大于40m2的一个房间或更大些，为了方便起见可将房间分为两个区:一是玻璃器皿的清洗、消毒、干燥区 二是培养基配制区：应有大型实验台若干个，还应配备常温冰箱一台，电炉(1000W，2000W)，微波炉，放置移液管、微量移液器的架子，酸度计等。

28 三、灭 菌 室 灭菌室面积可小一些，其内除放灭菌锅外，最好还有临时存放培养基、培养器皿的架子，也应有自来水装置。灭菌室可根据灭菌锅的多少，工作量大小来确定面积，要求房间能有较好的通风散热条件，且要配备专门的电源线路，因为电热灭菌锅的耗电量很大。

29 四、接 种 室 应有超净工作台、放置培养容器的架子等。最好设有缓冲间和双层门窗，以防灰尘和微生物。房间内应装紫外灯或经常喷洒杀菌剂，以抑制过多微生物生长。在进入接种室之前在缓冲间内更换衣服、鞋帽、穿好工作服，戴上口罩、防尘帽，换上拖鞋才能进入接种区，进入接种区之后随手把活动门关上。 缓冲间 接种室

30 五、培养室 培养室最重要的是要恒温、恒湿，无尘且空气流通。温度应维持在(25±3)℃，相对湿度应在50％～60%。 培养室内所有光照和黑暗应由定时器自动控制。整个培养室内还应装有一个或多个紫外灯，以便能定时对整个房间进行杀菌处理，特别是在夏天潮湿、霉雨季节，最好每天在晚上用紫外灯杀菌30 min以上。培养室内的地面、墙壁、培养架及所有器物的表面都应经常清洗、擦拭以防过多灰尘和微生物滋生。

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32 六、培养物的检测与观察记录室 对培养物进行及时的检测和观察记录是研究植物组织培养的重成部分之一，检测与观察记录室最好单独设立一个房里面摆放实体解剖镜、显微照相和记录设备 。

33 第五章 植物组织培养的常用培养基及培养基配制
第五章 植物组织培养的常用培养基及培养基配制

34 目前常用的培养基有10余种之多，大部分都是在前人研究的基础上经过分析综合和改进而成的。
如White培养基是Uspenski(1925)的藻类培养基演化的结果，被广泛用于根的培养；Gautheret培养基是建立在Knop营养液(1865)基础上的。以后的培养基大部分是在White和Gautheret培养基的基础上改进而成。

35 （一）、无机营养成分(大量元素，微量元素和铁盐)
一、培养基的成分 （一）、无机营养成分(大量元素，微量元素和铁盐) 1、大量元素：浓度大于O.5mmol／L的元素。 氮：常以硝态氮(N03)或氨态氮(NH4)，或两者相互配合的形式存在。缺氮时愈 伤组织会出现花色素苷的颜色，愈伤组织内部不能形成导管。 磷：以NaH2P04·H2O、KH2P04或(NH4)H2P04的形式提供。 钾：KCl、KN03或KH2P04 钙：CaCl2·2H2O、Ca(N03)2 镁：常以MgS04·7H2O的形式，既提供了镁也提供了硫。 缺硫时培养的植物组织会明显的退绿；缺磷或钾时细胞会过度生长，愈伤组织表现出极其蓬松状态。

36 2．微量元素：指小于O.5mmol／L的元素。
铁(Fe)、锰(Mn)、铜(Cu)、锌(Zn)、氯(C1)、硼(B)和钼(Mo)等。 铁作为一种微量元素，对植物也是必需的，但由于Fe很不稳定、易沉淀，需要在酸性条件下才能比较稳定，故在培养基配制时常把Fe盐单独配制，常以螯合物的形式，把FeS04和它的螯合剂乙二胺四乙酸钠(Na2EDTA)先分别配成溶液，再相互混合使形成螯合铁，以防止沉淀和帮助被植物吸收。

37 （二）、有机营养成分 维生素: 除维生素B1、维生素B6、烟酸之外，在部分培养基中还添加维生素C(抗坏血酸)、维生素H(生物素)等。 甘氨酸(氨基乙酸)和肌醇(环己六醇): 肌醇主要以磷酸肌醇和磷脂酰肌醇的形式参与由Ca介导的信号转导。 在某些植物或组织的培养中还加水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰子汁、玉米胚乳、麦芽浸出物、西红柿汁和酵母浸出物等。

38 （三）、碳水化合物 通常为蔗糖或葡萄糖，用量通常为2％～4%，高者可达5％，亦可用市售的白糖所代替。
几乎所有的培养物在蔗糖作为碳源时生长都比较好，只有少数植物或组织在葡萄糖或果糖作为碳源的培养基上生长更合适。也有用麦芽糖、半乳糖、甘露糖、山梨醇和乳糖作为碳源的。

39 （四）、植物生长调节物质 NAA(萘乙酸)，IAA(吲哚乙酸)，IBA(吲哚丁酸)，NOA(萘氧乙酸)，2，4一D(2，4一二氯苯氧乙酸)，
1．生长素：主要用于诱导细胞分裂和根的分化。 NAA(萘乙酸)，IAA(吲哚乙酸)，IBA(吲哚丁酸)，NOA(萘氧乙酸)，2，4一D(2，4一二氯苯氧乙酸)， 2，4，5一T(2，4，5一三氯苯氧乙酸)。 2，4一D对愈伤组织增殖最有效的，特别是对单子叶植物。但2，4-D是一种极有效的器官发生抑制剂，不能用于启动根和芽分化的培养基中。

40 2．细胞分裂素 3．赤霉素 刺激细胞分裂，诱导芽的分化、叶片扩大和茎长高，抑制根的生长。 天然CTK：玉米素,玉米素核苷，二氢玉米素 。
人工合成CTK: 激动素(KT)、6-苄基腺嘌呤(6-BA)、2ip(异戊烯氨基嘌呤)、和TDZ(thidiazuron，噻二唑苯基脲)、独角金内脂等 。 3．赤霉素 主要是GA3。用时需过滤灭菌，促进试管苗伸长、种子萌发。

41 （五）、琼脂或其他支持物 除液体悬浮培养外，所有的培养物都应生长在固体或半固体的培养基上,以防止培养物沉人液体培养基，因缺氧而死亡。
琼脂是一种极为理想的支持物。它是由海藻得来的多糖类物质，但并不是培养基中的必需成分，只是作为一种凝固剂使培养基变成固体或半固体状态。

42 （六）、其他添加物 酵母提取物，椰乳，香蕉粉，橘子汁，活性炭，渗透调节剂、水解酪蛋白、水解乳蛋白等。
活性炭：能从培养基中吸附许多有机物和无机物分子，可清除培养中植物组织在代谢过程中产生的、对培养物有不良或毒副作用的物质，也可以调节激素的供应。还有刺激胚胎发生(如烟草花药培养)的作用。

43 渗透调节剂： 常选用一些代谢微弱的糖来充当，如甘露(糖)醇、山梨醇和聚乙二醇等，这些糖基本上不被培养的植物组织所吸收，而只存留在培养基中，起到调节渗透的作用。 抗生素： 培养的植物组织内部携带有病原物，表面消毒不解决问题时，可在配置培养基时添加抗生素，如加200～300U的庆大霉素可使细菌污染受到很好的控制。

44 二、培养基的选择 1．选择合适的培养基 基本培养基： MS培养基适合于大多数双子叶植物，B5和N6培养基适合于许多单子叶植物， White培养基适于根的培养 。

45 激素浓度和相对比例的确定 先参考已有的报道，看是否有用相同植物、相同组织或相近者做过成功或失败的试验，如果有则直接作为参考；如果没有，则在建立激素配比中，将每一种拟使用的激素选择3～5个水平，再按随机组合的方式建立起如下的实验方案。 表1 两种激素4种浓度的组合实验 生长素浓度／mg·L 细胞分裂素浓度／mg.L-1   O O 1.O 2.O

46 生长素浓度／mg·L-1 细胞分裂素浓度／mg.L-1 1.0 1.25 1.50 1.75
表2 第二次激素配比实验 生长素浓度／mg·L 细胞分裂素浓度／mg.L-1 O

47 三、培养基的配制 （一）、配制母液 （二）、配制培养基

48 (三)、配制培养基时应注意的有关问题 1、高温灭菌的基本过程 检查灭菌锅内有无足够量的水，最好用蒸馏水或去离子水，因为自来水含有较多的矿物质，容易使锅内形成水垢，影响锅的使用寿命。将需要灭菌的器皿、培养基等放入锅内，不要装得太满，以不超过锅的容量3／4为宜。

49 2、高温下培养基成分的降解 经高温灭菌后赤霉素GA3的活性仅及不经高温灭菌的新鲜溶液的10％。
NAA、2，4一D、激动素和玉米素在高温下是比较稳定的。 蔗糖经高温后部分被降解成D-葡萄糖和D-果糖，果糖又可被部分水解，产生抑制培养的植物组织生长的物质。 高温可使碳水化合物和氨基酸发生反应。 维生素具有不同程度的热稳定性，培养基的pH值高于5.5，则维生素B1会被迅速降解。