Chapter 5 蛋白质组学

一、概述

1、什么是蛋白质组？

2、

二、常规蛋白质组学研究技术 双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。蛋白质组研究的技术路线如下图： 样品 细胞、组织、体液 直接1 继续处理2 电转印到膜上 图象分析，数据处理 双向电泳 继续处理3 胶上原位酶切

2 3 肽混合物 Edman降解 氨基酸分析 MALDI/TOF/MS N端序列 氨基酸组成 PSD/MALDI/ TOF/MS ESI/MS/MS 肽质量指纹谱 数据库检索 肽序列标签

蛋白质鉴定 寡核苷酸合成 蛋白实验 免疫组化 肽合成 基因 蛋白活力 蛋白定位 抗体 蛋白质组数据库

1、双向电泳 1）原理 Smithies和Poulik(1956)最早引入了二维电泳技术，他们将纸电泳相淀粉凝胶电泳结合来分离血清蛋白质。随后二维电泳技术经历了更多的发展，并将聚丙烯酰胺介质引入应用，特别是等电聚焦技术在一向的应用，使基于蛋白质电荷属性的一向分离成为可能。目前所应用的二维电泳体系是O’Farrell等首先于1975年发明，其原理是根据蛋白质的两个一级属性：等电点和相对分子质量的特异性，将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离(等电聚焦)，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS—PAGE)。

2）分辨力 在最好状态下，传统等电聚焦技术和SDS-PAGE在20cm左右长度的凝胶中可在各自方向上分辨出100个不同的蛋白质条带，因此，理论上的二维电泳分辨能力可达到10 000个点。目前已有实验室在30cm x 40 cm的大胶上获得这一分离效果。考虑到大多数实验室并不具备运行这种大胶所需要的条件，普通情况下的凝胶(20 cm x 20 cm)分辨到3000个点已是相当不错。但利用特殊的样品制备方法如三步提取或亚细胞器提取，以及窄范围等电聚焦胶条，都可大大提高二维电泳的分辨能力。二维电泳分离后的蛋白质点经显色方法如考马斯亮蓝染色、银染、负性染色、荧光染色或放射性标记等染色处理后，通过图像扫描存档，最后呈现出来的是在二维方向排列的呈“满天星”状排列的小圆点，其中每一个点代表一个蛋白质.

灵敏度100ng 灵敏度200pg 由于银染成本较低，在目前仍然是差异蛋白质组分析中最常用的显色方法，但由于银染过程中醛类的特异反应，使得对凝胶酶切肽谱提取存在困难。大多数实验室的策略是采用银染凝胶进行图谱分析，然后加大上样量，进行考染并将凝胶切下用于下游鉴定。

FLA-5000-image: Sypro Ruby stained 2 D-gel, brain proteins

2、图像分析与细胞蛋白谱的建立 1）必要性：要对上千个蛋白质点进行分析，只有依赖于双向电泳凝胶分析软件，完整的图像处理包括图像的采集和双向电泳图像分析(图):

2）常用图像采集系统 常用的图像采集系统有： 电感偶合装置(change coupled devices,CCD) 光密度扫描仪 激光诱导荧光检测器等。

Image ScannerⅡ扫描仪 高灵敏度，高分辨，在扫描弱图像时不需散光板，能检测极微量的样品 硬件和软伯的校正功能，提高扫描质量 完整的14-bit图像解析度，准确定量有利于线性范围＞3.7OD 可选择波长，以降低背景，增加灵敏度 多种扫描速率有利于更快的图像摄录 应用广泛，适用于湿胶，杂胶膜，胶片等各种应用 与各种软件配合，能分析各种1D和2D电泳图

图像采集注意事项 常用几类扫描仪的分辨率均可达到1000dpi(dot per inch)以上，但设置dpi值太大，图像保真度虽然提高了，而图像所占字节数也大大增加，使软件在分析图象时对处理器的要求提高了，这样就大大延长了运行时间。在实际应用时，仪器分辨率设置为300dpi、8bits深度为宜，此时一块20cm x 20cm的双向点泳胶(Protean II，Bio-Rad)保存为tif格式的文件后，约占用 6Mb 的字节空间，分辨率低于300dpi时会失去某些光密度信息，高于300dpi时，分析软件所能识别的图像光密度信息得不到多大改善，而图形文件大大加大。由于目前所用的凝胶分析软件只能识别256色的图像，要求在扫描时设定图像色彩为256色。

◆蛋白质点检测 （spot detection）； 3）图像分析软件 经过多年的发展，目前已形成了比较完善图像分析系统，图像分析软件有melanie II&3&4、PDQuest 6.1、ImageMaster 2D Elite 3.10、Phoretix 2D、英国公司Nonlinear Dynamics Ltd.的Progenesis、德国 Decodon GmbH的Delta2D等，它们的基本功能是相近的，都包括以下几个步骤: ◆蛋白质点检测 （spot detection）； ◆背景消减 （background subtraction）； ◆归一化处理 (normalization)； ◆蛋白质点匹配 (spot matching)。

3、质谱分析技术 1）生物质谱技术的发展 质谱分析法是通过测定样品离子的质荷比(m/z)来进行成分和结构分析的分析方法。 自1886年Goldstein发明早期质谱仪器常用的离子源，到1942年第一台单聚焦质谱仪商品化，质谱基本上处于理论发展阶段。真正意义上的变革以80年代中期出现的两种新的电离技术：电喷雾电离和基质辅助激光解吸电离为代表，这两种技术所具有的高灵敏度和高质量检测范围，使得在fmol(10-15)乃至amol(10-18)水平检测相对分子质量高达几十万道尔顿的生物大分子成为可能，从而开拓了质谱学一个崭新的领域—生物质谱．促使质谱技术在生命科学领域获得广泛的应用和发展.

◆美日瑞三国科学家分享2002年诺贝尔化学奖 瑞典皇家科学院把２００２年诺贝尔化学奖授予美国科学家约翰·芬恩、日本科学家田中耕一和瑞士科学家库尔特·维特里希，以表彰他们发明了对生物大分子进行识别和结构分析的方法，其中芬恩和田中的贡献在于开发出了对生物大分子进行质谱分析的“软解吸附作用电离法”，维特里希的贡献是开发出了用来确定溶液中生物大分子三维结构的核磁共振技术。他们三人的这些研究成果对于研究包括蛋白质在内的大分子具有“革命性的”意义。   质谱分析是全世界各个化学实验室都在使用的一种非常重要的分析手段。以前，它只是用于小分子的分析研究。现在，由于芬恩和田中的发明，质谱分析也可以用于生物大分子的分析研究。利用芬恩１９８８年所公布的研究成果，研究人员可以获得电荷蛋白质液滴，并最终获得自由盘旋的蛋白质离子，通过使它们运动可以确定其质量，测出飞过指定距离所用的时间。同时，田中还发明了另一种可以造成蛋白质自由盘旋的技术——软激光解吸附作用技术。研究人员可以用这种技术把取样击成许多小块，迫使分子释放出来。  

约翰·芬恩 田中耕一 芬恩1917年生于纽约，1940年获美国耶鲁大学化学博士学位，现为美国弗吉尼亚联邦大学教授。田中1959生于日本富山市，毕业于日本东京大学，现是日本京都市岛津制作所研究与开发工程师。

2）质谱仪的基本组成 进样系统 离子源 质量分析器 检测器 1.单聚焦 2.双聚焦 3.飞行时间 4.四极杆 1.电子轰击 2.化学电离 3.场致电离 4.激光 1.气体扩散 2.直接进样 3.气相色谱

3）主要离子源 基质辅助激光解吸电离(Matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI)技术 电喷雾电离（Elaectrospray Ionization-ESI）技术

MALDI原理 将分析物分散在基质分子(尼古丁酸及其同系物)中并形成晶体，当用激光(337nm的氮激光)照射晶体时，基质分子吸收激光能量，样品解吸附，基质－样品之间发生电荷转移使样品分子电离。基质的使用是这一电离技术的关键，基质吸收了激光的大部分能量并气化，同时将样品分子带入气相，样品分子只吸收少量激光能量，避免了分子化学键的断裂。基质在样品离子形成过程中充当了质子化或去质子化试剂，使样品分子带上正电荷或负电荷。

2) ESI原理 电喷雾电离方法是利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电，在N2的作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，直至产生的库仑斥力与液滴表面张力达到雷利极限，液滴爆炸为带电的子液滴，这一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈喷雾状，这时液滴表面的电场非常强大，使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的形式进入质量分析器。

4）飞行时间质量检测器 线性飞行时间质量检测器； 反射飞行时间质量检测器； 多级质量分析检测器：包括三级四极杆分析器(triple-quadrupole analyzer)、离子阱分析器(ion trap analyzer)和四极杆—飞行时间质量分析器(quadruple-time of light analyzer)。

● 线性飞行时间质量检测器(time of flight，TOF) 离子源中每一脉冲激光产生的离子先经过一个加速电场，获得动能，再进入一个高真空无电场飞行管道．离子在此无电场飞行管道内以在加速电场获得的速度飞行。质量较轻的离子飞行速度快，较早到达检测器，较重的离子飞行速度慢，较晚到达检测器，离子的飞行时间与其质荷比的平方根(m／z) 成正比，通过检测飞行时间来测定离子的质荷比。 t=const·

●反射飞行时间质量检测器 线性飞行管的MALDI-TOF-MS的质量分辨率和测量准确度不高，测量误差在2‰左右，不能满是蛋白质鉴定的需求。为了改进仪器的分辨率和质量测量准确度，在仪器的飞行管道内加了一个反射电场。反射电场可起能量聚焦作用，即具有相同质荷比但能量有细微差异的离子在反射电场作用下飞行时间达到一致，同时离子改变了飞行方向，延长了飞行距离，所以反射飞行时间质谱(RETOF-MS)的分辨率和质量测量准确度都有了很大提高。

●四极杆—飞行时间分析器 四极杆—飞行时间分析器是由四极杆分析器和飞行时间分析器串联构成，四极杆分析器用于离子选择，其后有一个六极杆射频场用于离子的碰撞，诱导解离产生子离子，母离子和子离子的检测均由最后的飞行时间检测器完成。

5）主要质谱仪 MALDI-TOF/MS; ESI-Q-TOF/MS; MALDI-TOF-TOF/MS; ESI-MS/MS; HPLC-ESI-MS/MS.

●MALDI-TOF/MS

●HPLC-ESI-MS/MS

6）质谱图 A: 离子的相对强度(Y axis) B: 离子的质量与电荷比(m/z, X axis) C: 质谱图中最强的峰称为基峰(base peak) D: 相对于特定的检测器时称为峰的绝对强度 E: 所有质谱峰对应的是离子电信号强度和离子应在m/z位置而非真实的离子强度和离子. F: 棒状谱(centroidal peak) G: 高斯峰(gauss peak)

MALDI-TOF/MS 图 血蓝蛋白胰蛋白酶酶切肽图

LC-ESI-MS/MS图谱

4、运用生物质谱技术鉴定蛋白质 蛋白质的鉴定方法主要是利用蛋白质的各种属性参数(attribute parameter)如相对分子质量、等电点、序列、氨基酸组成、肽质量指纹谱等在蛋白质数据库中检索，寻找与这些参数相符的蛋白质。 目前主要为： 肽质量指纹谱(peptide mass fingerprinting，PMF)鉴定蛋白质 串联质谱（MS/MS）数据——氨基酸序列鉴定蛋白质

1）PMF鉴定蛋白质 （1）原理： 用PMF鉴定蛋白质是目前蛋白质组研究中较为常用的鉴定方法．这一技术于1993年被多个研究小组分别独立提出，肽质量指纹谱是指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于每种蛋白质的氨基酸序列(一级结构)都不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物质量数亦具特征性，所以称为指纹谱，可用于蛋白质的鉴定，即用实验测得的蛋白质酶解肽段质量数在蛋白质数据库中检索，寻找具有相似肽指纹谱的蛋白质。电泳胶上的蛋白质可被原位酶切或转印到PVDF膜上酶切得到肽混合物，经质谱分析得到PMF，检索数据库进行鉴定。

（2）实验路线

（3）主要数据库

（4）示例 Fig of Ap73a

Result of Ap73a 甲基化尿素

三、应用 1、在肿瘤研究中的应用 蛋白组学技术为肿瘤研究拓开了新的途径,该技术能够动态、整体、定量地观察肿瘤的发生、发展过程。组织或器官癌变后,所引起的蛋白质种类和(或) 数量的变化,通过比较正常和“病变”细胞或组织中蛋白质表达的数量、位置以及修饰状态等方面的差异,可以发现与病理改变相关的蛋白质和疾病特异性蛋白质。主要用于: ①肿瘤标记物的筛选及鉴定; ②肿瘤分类及早期筛查; ③肿瘤的疗效评估及预后判断; ④探索肿瘤的发生机制; ⑤已知肿瘤相关基因产物的研究。

示例——肝癌

2、在药物研究中的应用 随着基因组学、组合化学和高通量筛选等现代科技的发展,以药物发现为中心的药物研究不断取得新的突破。特别是蛋白质组学这门新科学的发展,大大加速和简化了新药开发的过程。蛋白质组学作为一种全新的技术平台,正日益广泛地应用于药物研究中。

1）药物靶点的发现与药物靶点的确认 药物进入机体后多是通过与特异的靶蛋白作用而发挥药效达到治疗作用的,蛋白质组学通过比较细胞或组织在健康或疾病状态下蛋白质数量或形态上的差异,建立蛋白质组图谱,并用相关软件对蛋白质图谱进行分析,发现疾病相关蛋白质,找到有效的药物靶点。 许多研究小组利用蛋白质组手段来研究白血病、肺结核、肝炎、慢性骨骼疾病、心血管疾病及肿瘤等对人类威胁较严重的疾病的新药靶,其已经成为疾病诊断、监测、治疗的有力工具。如Donohoe 等利用同位素亲和标签技术及串联质谱技术从胰腺癌患者的癌组织中鉴定出151 种蛋白质与正常胰腺组织相比异常表达,这些蛋白质有望成为胰腺癌有效治疗的新的靶点;

药物研究的目的不仅在于要寻找到新的药物靶点,而且还要对新发现的靶点进行验证,确认它们确实在疾病发展过程中起着重要作用。目前,蛋白质组学技术为药物靶点的验证提供了快速有效的方法。 Biplab 等运用蛋白质组学技术研究Ⅰ型神经纤维瘤基因缺陷或突变体的蛋白质表达时发现,促核糖体生物合成蛋白及哺乳类动物的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin ,mTOR) 表达增加,而抑癌蛋白－神经纤维瘤蛋白的表达降低;抑制mTOR 的活性及信号转导通路,则能恢复神经胶质细胞的正常增殖速率,减少恶性增殖,从而提示 mTOR 是神经胶质细胞恶性增殖的关键蛋白,为治疗Ⅰ型神经纤维瘤基因缺陷或突变型神经系统肿瘤提供了有效的新的药物靶点与思路。

2）在药物作用机制研究中的应用 目前,不仅仅是新开发的药物,就是许多现有的药物其作用机制还不甚清楚。近年来运用蛋白质组学技术,分析一些活性化合物处理过的细胞、组织或体液表达的蛋白质组,构建差异蛋白质表达谱检测药物处理前后复杂的蛋白质的改变情况,可以更清楚更详尽地阐明药物的作用机制。 喹啉类药物用于治疗疟疾已经多年,但其治疗机制始终不清楚。Graves 等研究了喹啉作用后的蛋白质图谱,发现醛脱氢酶1 (ALDH1) 和苯醌还原酶2 (QR2)在人和小鼠红细胞裂解液中有表达,而在恶性疟原虫内则没有,且体外研究表明喹啉类药物可以强烈抑制 QR2 的活性。 从而提示这两种酶可能是喹啉类药物的作用靶点,喹啉类药物的作用可能与抑制疟原虫这两种酶的作用有关。

3）药物毒理学研究 蛋白质组学还可用于药物的毒理学研究。通过比较给药前后细胞的蛋白质变化,可以鉴别出其毒理学的蛋白质标志物,弄清毒理学的分子机制,建立一个相应于特异性药物的组织蛋白质数据库,获得药物毒理学信息。通过该数据库可以快速准确地筛选或预测药物的毒性,推断某个新化合物的毒性反应。 目前,蛋白质组学用于研究药物毒性作用机制的例子不 胜枚举,如Charlwood 等研究了庆大霉素作用后的肾脏双向电泳图谱,发现涉及柠檬酸循环、糖异生及脂肪酸的合成蛋白质发生了改变,从而有力地支持了庆大霉素毒性是由于能量产生受阻和线粒体损伤而导致肾脏毒性。

3、在农业中的应用 蛋白质组学技术在农业科学研究中具有广泛的应用，如核不育和细胞质雄性研究，病虫害等生物胁迫蛋白质组学研究，缺氧胁迫、热胁迫、损伤胁迫等非生物胁迫研究、各种突变体研究、组织和细胞器（叶绿体、线粒体等）蛋白质组研究等。

●不育性蛋白质组研究 文李等(2006) 采用双向电泳和对MALDI-TOF质谱技术分析了红莲型细胞质雄性不育水稻的不育系和保持系单核期花粉总蛋白质。不育系相对于保持系有部分参与碳代谢和淀粉合成的酶缺失或表达量降低，这些蛋白质分别是ADP- 葡萄糖磷酸转移酶(AGPase)、UDP- 葡萄糖醛酸脱羧酶、乙酰辅酶A合成酶和二氢硫辛酸脱氢酶等。推测它们的缺失或表达量降低有可能导致因线粒体提供的能量不足，淀粉合成受阻，因而花粉不能正常发育。

●生物胁迫蛋白质组研究 陈荣智等(2002)利用双向电泳技术，分析水稻抗虫材料、感虫材料受虫害与未受虫害的秧苗蛋白质的变化，找到一个分子量为40kD、等电点为6.3 的差显蛋白质P40，推测P40 与水稻受褐飞虱虫害后引起的应答反应相关。 Campo 等(2004)在研究玉米萌发种胚对真菌侵染后的防御反应时发现，有9 个蛋白在真菌侵染后上调表达，它们主要参与植物组织抗氧化和解毒、蛋白质的合成和折叠。特别是翻译起始因子elF-5A 表达量提高，暗示它可能与植物防御反应直接有关。

4、在病原微生物中的应用

1）病原微生物鉴定

2）病原微生物耐药机理的研究

3）新型疫苗的研究

4）病原菌致病机理的研究

四、示例

凡纳滨对虾中一种类IgA蛋白的鉴定及其凝集活性的研究 报告人：章跃陵 博士/副教授 汕头大学理学院/广东省海洋生物学重点实验室 E-mail:zhangyl@stu.edu.cn

一、立题思路 一般认为，无脊椎动物体液中不具有免疫球蛋白。但近年来，许多学者在无脊椎动物中证实了免疫球蛋白超家族分子，甚至初级适应性免疫的存在。关于虾内是否存在类Ig物质，尚存在争论。本研究运用亲和蛋白质组学，基因克隆和生物信息学等现代生物学技术，以凡纳滨对虾为研究对象，对对虾血清中的类IgA物质进行分离、纯化、鉴定和功能分析，为丰富虾类免疫系统研究，探索对虾疾病免疫学防治奠定基础。

二、研究路线 类IgA的亲和纯化与鉴定 类IgA与IgSF分子相互作用分析 类IgA与病原菌相互作用分析 类IgA凝集活性分析

三、研究结果与分析 3.1 亲和纯化类IgA Shrimp serum Anti-human IgA IgA-like protein

3.2 1-DE/2-DE and 1-D/2-D Immunoblotting 77kDa 75kDa 64kDa 97.4 kDa 66.7 43.0 31.0 20.1 14.4 1 2 3 A B C 9.5 3.0 pI Fig.1 1-DE/2-DE and 1-D/2-D immunoblotting analysis of IgA-like proteins

小结：从Fig.1可知, 亲和层析洗脱蛋白表现为表观分子量分别为77 kDa, 75 kDa (Ap75) 和64 kDa 的3个蛋白，其中Ap75（IgA-like) 与抗人IgA抗血清反应呈阳性。

3.3 Ap75 生物质谱鉴定 1、 MALDI-TOF/MS分析 Fig.2 MALDI-TOF/MS of Ap75 PMF of Ap75 the mowse score of Ap75 by Mascot, Protein scores greater than 72 are significant (p<0.05). The score of hemocyanin (L. vannamei) [gi|854403] is 82.

2、ESI-MS/MS 分析 Fig.3 ESI-MS/MS of Ap75 ESI-MS spectra of Ap75 ESI-MS/MS spectra of fragment at m/z 546.27 Fig.3 ESI-MS/MS of Ap75 FESATGLPNR

Fig.4 the Mascot search mowse score of Ap75 by ESI-MS/MS analysis. Table 1: Matched amino acid sequences of Ap75 identified as L. vannamei hemocyanin by ESI-MS/MS analysis. m/z Mr (expt) Mr (calc) Delta Miss Score Rank Start-end Sequence 474.24 946.47 946.48 -0.01 17 1 410-417 DNLPPYTK 489.28 976.55 976.56 12 5 27-34 DVLYLLNK 501.27 1,000.52 -0.00 45 70-78 LVQDLNDGK 533.25 1064.48 59 291-298 FEDVDDVAR 546.27 1090.53 1090.54 58 566-575 FESATGLPNR 554.78 1107.54 1107.56 -0.02 46 640-648 VFEDLPNFK 483.57 1447.70 1447.72 13 3 278-290 YGGQFPARPDNVK 492.24 1473.70 1473.71 39 312-325 DAIAHGYIVDSEGK Probability Based Mowse Score Number of Hits Fig.4 the Mascot search mowse score of Ap75 by ESI-MS/MS analysis. Individual ions scores >42 indicate identity or extensive homology (p<0.05). The score of L. vannamei hemocyanin is 290.

小结:从Fig.2－4，Table.1 可知，经MALDI-TOF/MS 和 ESI-MS/MS 鉴定，Ap75蛋白为凡纳滨对虾血蓝蛋白75kDa亚基。由此认为，对虾血清中与抗人IgA发生特异性结合的蛋白为血蓝蛋白75kDa亚基。 进一步研究问题：血蓝蛋白为何可以与抗人IgA相结合，其分子结构基础是什么？

3.4 凡纳滨对虾血蓝蛋白与抗人IgA相结合的分子结构基础研究 1、血蓝蛋白75kDa亚基Conserved domain 分析 利用NCBI数据库BLAST 软件分析与抗人IgA相结合的血蓝蛋白75kDa亚基的保守区，发现在其C末端存在一个长252个残基的Ig-like domain 。 Fig.5 The Ig-like conserved domain of L.vannamei hemocyanin monomer with 75kDa 问题：既然血蓝蛋白75kDa亚基存在一个Ig-like domain，那么其与抗人IgA分子相结合的区域是不是就是其Ig-like domain？

2、Ig-like区的亚克隆和表达及Immunoblotting分析 Fig.6 1% agarose gel electrophoresis of PCR product of Hc-I gene. Fig.7 SDS-PAGE and Immunoblotting analysis of Hc-I gene expression product 35kDa Reacted with Anti-human IgA Antibody specially 777bp

小结：由Fig5－7可知，血蓝蛋白75kDa亚基与抗人IgA分子相结合的分子基础是其Ig-like domain。也就是说，血蓝蛋白可以作为一种IgSF分子与抗人Ig发生特异性结合。 进一步研究问题：一般认为，IgSF分子既具有与其它IgSF分子结合的能力，同时也具有与病原菌相结合的特性，那么血蓝蛋白是不是也可以与病原菌直接结合呢？

3.5 血蓝蛋白与病原菌的相互作用研究 1、SDS-PAGE分析 为了探索血蓝蛋白是否可以与细菌直接结合，我们将凡纳滨对虾血清分别与灭活副溶血弧菌、河弧菌、荧光假单胞菌和大肠杆菌等4种细菌孵育，然后依次运用离心取沉淀，蛋白解离离心取上清，浓缩，1-DE和质谱鉴定等方法探索虾血清中可与细菌直接结合的蛋白。 97.4 66.2 39.2 26.6 21.5 14.4 kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 77 kDa(p77) 75 kDa(p75) Fig.8 2-5: SDS-PAGE analysis of the affinity purified proteins bound with V. parahaemolyticus,V. fluvialis, P. fluorescens and E. coli respectively from Litop. vannamei serum Control 1、SDS-PAGE分析

2、MALDI-TOF鉴定 Fig.9 PMF of p75 Search Results of p75 and p77

小结：从Fig.9 和 Table.2 可知，虾血清中与4种虾病原菌直接结合的主要蛋白为血蓝蛋白，不难推测血蓝蛋白确实可以病原菌直接相结合。 进一步研究的问题：既然血蓝蛋白可以与病原菌直接结合，那么血蓝蛋白是否具有凝集细菌的特性呢？

3.6 血蓝蛋白凝集活性分析 选取副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、河弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌等6种虾类致病菌为研究对象，探讨血蓝蛋白的凝集活性。 Table.3 血蓝蛋白凝集活性大小 Fig.10 Agglutinative activity analysis Control Agglutinative assay

Table.4 糖凝集抑制活性 Agglutinative inhibition by N-acetylneuraminic acid Control Agglutinative inhibition by N-acetylneuraminic acid

小结：从Fig.10 和Table.3－4可知，血蓝蛋白确实具有细菌凝集活性，且其凝集活性可以被部分糖所抑制。 进一步研究问题：既然血蓝蛋白具有凝集活性且可以与细菌直接结合，那么其识别细菌的靶点又是什么呢？

3.7 血蓝蛋白与病原菌凝集作用靶点分析 1、作用靶位分析 为了探寻血蓝蛋白发挥凝集活性时与细菌的结合靶位，选取大肠杆菌K12和副溶血弧菌超声破碎菌液、外膜蛋白及大肠杆菌LPS进行血蓝蛋白凝集抑制分析。 Table. 5 Inhibition of agglutinative activity of hemocyanin with different bacteria by Omp of E.coli K12 and V. parahaemolyticus

2、与血蓝蛋白相结合的外膜蛋白的鉴定 为了进一步探讨血蓝蛋白与何种外膜蛋白相结合，以大肠杆菌k12外膜蛋白为研究对象，采用亲和蛋白质组学策略进行研究。 1 2 3 4 kDa 97.4 66.7 43.0 30.1 21.0 14.4 A B 3.0 9.5 pI p16 p18 Fig.11 1-DE and 2-DE analysis of bacterial outer membrane proteins that interacted with hemocyanin. 2: shrimp serum 3:Omp of E. coli K12 4: First: shrimp serum; Then: Omp of E. coli K12

Fig.12 PMF of p18 Search Table.2 The homologous search results of the PMF of the proteins of p16 and p18

3、血蓝蛋白凝集作用靶点的鉴定 由此提示，OmpX应为血蓝蛋白发挥凝集活性的作用靶点。 为了进一步证实OmpC和OmpX是否为血蓝蛋白发挥凝集活性的作用靶点，分别选取大肠杆菌K12外膜蛋白OmpC和OmpX敲除菌（△OmpX、△OmpC）为研究对象，考察血蓝蛋白对其凝集活性的变化。 Table.6 Agglutinative activity of hemocyanin with mutant of E. coli K12 △ 由此提示，OmpX应为血蓝蛋白发挥凝集活性的作用靶点。

小 结 本研究采用亲和蛋白质组学策略对虾血清中的类IgA蛋白进行了鉴定、功能和免疫学机制的研究，结果发现： 1、对虾血清中与抗人IgA发生特异性结合的类IgA蛋白为血蓝蛋白75kDa亚基； 2、血蓝蛋白75kDa亚基与抗人Ig结合的分子结构基础为其Ig-like domain； 3、血蓝蛋白既可与抗人Ig等IgSF分子结合，还可与病原菌直接结合； 4、血蓝蛋白对 6 种虾病原菌具有凝集活性，且其凝集活性可以被部分糖所抑制； 5、血蓝蛋白发挥凝集活性时识别病原菌的作用靶点可能为OmpX。

所获研究结果已发表或待发表的论文 1. Zhang, Y.L., Wang, S.Y., Xu, A.L., Chen, J., Lin, B.K., Peng, X.X. Affinity proteomic approach for identification of an IgA-like protein in Litopenaeus vannamei and study on its agglutination characterization.J.Proteome Res. 2006, 5:815-821 (IF, 6.92)； 2.章跃陵, 林伯坤, 陈俊, 等. 凡纳滨对虾血蓝蛋白的细菌凝集活性. 中国水产科学, 2006, 13(6):1006-1011； 3.章跃陵, 林智建，李祖江，等. 凡纳滨对虾血清中直接与病原菌相结合的主要蛋白的鉴定. 水产学报 （已接受，待发）； 4.章跃陵，严 芳，樊大军, 蒋瑞萍，胡 忠，李远友. 凡纳滨对虾血蓝蛋白与病原菌凝集作用靶点的鉴定. 中国生物化学与分子生物学报（在投）。

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