小麦颖果发育过程中的胚乳程序性细胞死亡 学生：陈永惠 学号：M05309 导师：王忠教授 2006年11月21日

报告内容 1.选题的依据及意义 2.研究背景 3.研究内容、试验材料及方法 4.可行性分析与预期研究结果 5.研究工作的进度安排

什么是程序性细胞死亡（PCD）？ 植物的程序性细胞死亡是植物体在发育过程中或环境影响下，通过自身的内部机制启动并调节的细胞生理性自然死亡的过程。作为主动的死亡过程，其主要特征是高度的自控性，发生部位和发生时序的准确性 。

维管植物中发生PCD的细胞类型（Pennell and Lamb，1997）

PCD的特征 在形态上，PCD的细胞先以细胞质和细胞核浓缩、染色质边缘化为特征，随后由膜包围DNA片段而形成凋亡小体； 在生化上，PCD的细胞表现为核酸内切酶活性增加，核DNA从核小体间降解断裂，产生带有3‘-OH末端的、大小不同的寡聚核小体片段，这些片段在琼脂糖凝胶电泳时，可显示为“梯形”DNA条带(DNA ladder)； 在遗传上，植物与动物细胞PCD同样受到基因有序活动的控制，需要特定基因的转录和蛋白质合成，并可被特定基因的表达所抑制。

1.选题的依据、目地及意义 1.1 选题的依据 小麦淀粉胚乳细胞的PCD直接影响着胚乳细胞的充实状况，从而影响小麦的产量和品质。电镜观察是检测PCD的可靠方法，但是由于技术上的障碍，有关稻麦类作物胚乳细胞PCD期间超微结构变化的研究报道极少（李睿，2003）。有人对小麦胚乳细胞核消亡后继续灌浆的原因也做过推测，但是还没有研究证实；而氮素对小麦胚乳核消亡有何影响至今还未见报道。

1.2 选题的目的及意义 本研究在借鉴他人研究成果的基础上，将进一步阐明小麦胚乳程序性细胞死亡的发生过程，探明试验所设氮素营养对小麦胚乳PCD的影响；初探小麦胚乳细胞核消亡后灌浆继续进行的机理。本研究结果将为淀粉胚乳PCD过程的超微结构特征观察积累有价值的资料，进一步充实细胞生物学、形态解剖学和作物生理学等的有关知识，为小麦的生产提供新的理论与方法。

2.研究背景 2.1 关于胚乳细胞PCD的研究 长期以来，稻麦类作物胚乳发育过程中的细胞死亡现象未能与程序性细胞死亡相联系。直到1985年，尤瑞麟才在国内首次提出珠心细胞的死亡属于程序性细胞死亡现象(尤瑞麟，1985)。 在胚乳成熟期的中后期，淀粉胚乳细胞逐渐死亡(Olsen, 1998)。Young于1999年证实小麦和玉米淀粉胚乳在发育的中后期发生程序性细胞死亡（DNA laddering条带、PCD发生和扩展的方式）；水稻淀粉胚乳细胞PCD过程中细胞核出现变形、染色质凝聚、核膜破裂、核质外泄等衰退特征。但在细胞核的衰退过程中，内质网、线粒体、淀粉质体等细胞器仍有正常的代谢功能，细胞仍在合成并积累淀粉和储藏蛋白等营养物质（ wei ，2002）。

许多激素可参与植物细胞PCD的调控。乙烯可影响植物细胞DNA的片段化（ Granell ，1997）；Young于1997年用乙烯处理可诱导小麦和玉米胚乳提前发生PCD ；2000年提出胚乳细胞PCD的调控可能依赖于ABA和乙烯之间的平衡 。 乙烯处理使DNA片断化发生的时间提前，而使用ABA处理虽然不能推迟DNA片断化的发生时间，但能减弱DNA片断化的程度； ABA处理后小麦子粒最大灌浆速率增大，但活跃灌浆期的时间缩短，乙烯处理后所得结果相反 ABA虽能减弱DNA片断化的程度，但不能提高子粒重（李睿2004） 。

图版I 图版II 图版IA—图版II e所示为小麦淀粉胚乳细胞核的降解 图版II f-h细胞核解体过程中线粒体和内质网的伴随变化 李睿（2003）

2.2 关于小麦淀粉胚乳无核发育的推测 细胞核己解体不可能转录胚乳中淀粉合成相关酶类的mRNA，那么淀粉胚乳细胞的核解体后，灌浆物质又是如何合成的呢？ 推测水稻和小麦淀粉胚乳细胞中很可能存在一种特殊的核质关系。 （1）核解体后，淀粉胚乳细胞中总mRNA的数量和种类虽然减少，但无核发育期间需要的mRNA可能在核解体前已大量选择性转录。 （2）小麦淀粉胚乳细胞在细胞核解体后，胞质中的细胞器短期内仍有代谢功能，仍能维持细胞的正常代谢活动，继续合成和积累灌浆物质。无核发育阶段可视为胞质特殊的死亡形式 。

3.研究内容、试验材料及方法 3.1 研究内容 研究内容 胚乳细胞PCD过程的形态观察 胚乳细胞充实机理 3.1 研究内容 本研究在前人工作的基础上，利用现有的实验资源，对不同发育时期的胚乳细胞进行超薄切片，进一步观察胚乳细胞程序性细胞死亡的全过程，并对比施用氮素营养之后胚乳细胞程序性细胞死亡与对照有何不同。 胚乳细胞PCD过程的形态观察 研究内容 本研究在借鉴他人工作的基础上继续深入研究，探明小麦胚乳细胞在个发育时期的超微结构以及胚乳细胞的PCD规律。弄清胚乳PCD过程的控制因素，灌浆物质充实路径等。 胚乳细胞充实机理

3.2 实验材料 供试小麦品种为扬麦12号和扬麦15号。田间分期播种，在小麦的开花结实期设置小区施氮处理，不施氮素的小区作为对照，大田管理。采用记号笔标记花与植株上挂牌相结合的方法来标记开花日期与授粉时刻。在开花期每天标花，直标到全田开花结束，这样能在某一天里采集到发育不同天数或授粉后不同时间的颖果，供实验用。

3.3 研究方法 3.3.1 常规光镜和透射电镜观察制样 3.3.2 Evan’s blue染色法检测细胞死亡 3.3.3 细胞壁的荧光观察 3.3.4 发育期间水稻淀粉胚乳DNA电泳 3.3.5 胚乳细胞PCD过程中相关酶活力的测定 3.3.6 籽粒增重测定 3.2.7 供扫描电镜(SEM)观察的样品制作 3.3.8 灌浆物质进入胚乳途径的观察

活性氧是参与植物PCD的一种信号分子，在启动和调节细胞PCD的过程中起到了重要作用；线粒体基质和细胞质中的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT) 是植物体在植物内清除活性氧的两种抗氧化酶，在植物PCD中亦有重要作用。

4.可行性分析与预期研究结果 4.1 试验的可行性分析 对于本试验的研究，在进行胚乳细胞PCD形态观察的过程 中，关键的问题就是要解决颖果发育后期，由于子粒的充 实而难切片的问题，以及能拍出高质量的透射电镜图片。 这就要求在试验过程中要具备高质量的仪器设备，而且试 验时一定要认真仔细。 针对难切片问题，在试验时认真切片或者是再参考别人即 成的方法，相信该问题可以解决。另外，我们实验室具有 观察所需要的先进仪器，再加上王老师和师兄在电镜制样 技术上有丰富的经验可以提供技术指导，相信通过努力， 研究目标是能预期实现的。

4.2 预期研究结果 ① 阐明小麦胚乳程序性细胞死亡的发生过程； ② 探明试验所设因素对小麦胚乳PCD的影响； ③ 初探小麦胚乳细胞核消亡后灌浆继续进行的机理。

5.研究工作的进度安排 ① 2006年4月～2006年7月 广泛查阅国内外有关文献，寻找试验方法；期间正值小麦开花结实期，进行每日田间标花，取发育不同天数的颖果进行固定、包埋，制成树脂块； ② 2006年8月～2007年1月 对固定包埋好的试验材料进行切片，光镜下预先进行形态观察；10月份种植小麦； ③ 2007年3月～2007年7月 在小麦开花结实期进行氮素处理，对照不施氮肥；进行田间大量标花，采集发育不同天数的颖果分别进行酶的测定、DNA的提取与电泳、子粒增重测定、以及样品的固定与包埋，对材料部分进行超薄切片、电镜观察； ④ 2007年8月～2008年1月 对包埋好的样品继续进行超薄切片、电镜观察；10月份种植小麦，若是部分试验未能完成可继续取材；继续查阅国内外相关文献。 ⑤ 2008年3月～2008年7月 整理试验结果，撰写毕业论文。

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