抗菌肽及新基因工程药物研究

主要内容 何谓抗菌肽? 抗菌肽之种类 抗菌肽的作用机理 抗菌肽的基因克隆和研究策略 基因工程药物研究开发概述 新的基因工程药物研究策略

何谓抗菌肽? 最初人们发现这类活性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名为“antibactetial peptides，ABP”，中文译为抗菌肽，其原意为抗细菌肽。 抗菌肽是生物体自身合成的一种20至60个氨基酸的小肽，它能破坏细菌细胞膜，造成穿孔，引起细菌代谢功能紊乱而死亡；还能抑制病毒DNA复制；对肿瘤细胞有选择性杀伤作用。 抗菌肽（anti－microbial peptides）是生物体内诱导产生的一类具有抗菌作用的生物活性肽，在机体抵抗病原入侵方面起着重要作用。

抗菌肽发现 世界上第一个被发现的抗菌肽是1972年由瑞典科学家G.Boman等人经注射阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生的具有抗菌活性的多肽，定名为Cecropins 20世纪80年代初，瑞典斯德哥尔摩大学的汉斯鲍曼先生首次从蝴蝶身上分离出一类具有很强抗菌能力的肽； 随后法国苍蝇和蝴蝶研究专家、法兰西科学院院士儒尔霍夫曼证实了这些肽的存在。他们用事先浸泡在细菌培养液中的针头对昆虫进行注射，发现细菌对昆虫没有产生任何影响，而在12至24小时以后，昆虫产生了大量的抗菌肽.

抗菌肽特点 已发现了300多种内源性抗菌肽，可大致分为4类：富含cys残基的Defensin（防御素）；富含pro残基的Magainin（蛙wa皮素）；富含gly残基的Melittin（蜂毒素）； CecroPin（杀菌肽）类。 天然抗菌肽通常是碱性小分子多肽，水溶性好，分子量大约为4000道尔顿左右。大部分抗菌肽具有热稳定性，在l00℃下加热10～15min仍能保持其活性。多数抗菌肽的等电点大于7，表现出较强的阳离子特征。同时，抗菌肽对较大的离子强度和较高或较低的pH值均具有较强的抗性。此外，部分抗菌肽尚具备抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力。

抗菌肽特点 具有热稳定、水溶性好、广谱杀菌（有的甚至能杀真菌、原虫）等优点。 与抗生素的作用机制完全不同，不易产生耐药性，显示了抗菌肽具有独特的研究和应用价值。

抗菌肽的三维结构

几种不同来源抗菌肽的AA序列 Rabbit defensin(NP-1) VVC1AC2RRALC3LPRERRAGFC3RIRRGRIHLC2C1RR Crab tachyplesin RRWC1FRVC2YRGFC2YRKC1R Bovine bactenecin RLC1RIVVIRVC1R Silk-moth cecropinA KWKFKKIEKMGRNIRDGIVKAGPAIEVIGSAKAI Bovine indolicidin ILPWKWPWWPWRR Bacterial nisin IXA1IULA1Z2PGA2KZ3GLAMGA3NMKZ4AZ5A4HA5SIHVUK

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Representative structures of antimicrobial peptides.

抗菌肽的种类 微生物来源的抗菌肽 动物（包括昆虫）来源的抗菌肽 人体来源的抗菌肽 植物来源的抗菌肽

Mouse mDEFB3 and mDEFB4 sequence alignment

微生物来源的抗菌肽 1945年从Bacillus licheniformis var Tracy)菌株中分离到的一种环状多肽类拮抗物质，命名为杆菌肽（Bacitracin 分子量约为1.4Kda,在生物体内它不在核糖体内合成（非基因编码），而是通过内硫代模板机制合成，具有对蛋白质水解酶的抗性，其水溶液在弱酸性（pH5－7）较稳定，在pH9.0以上易失活，对热敏感，并且杆菌肽的抑菌活性需要依赖二价的金属离子，如Zn(II)，Co(II), Ni(II), and Cu(II)等。其中以锌对其活性的增强作用最大。至今以发现了9种杆菌肽成分，其中以Bacitracin A活性最高。

微生物抗菌肽 1993年从一株地衣芽孢杆菌A12中分离到两种阿米巴素（amoebicinsA12－A 和A12－B），拮抗酵母、真菌和部分细菌，分子量1430； 1994年从地衣芽孢杆菌M－4发现三种抗菌肽（阿米巴素m4-A, m4-B, 和 m4-C），分子量为3000Da到3200Da。对人体致病性和非致病性阿米巴有溶解作用，并且具有较广的杀真菌作用和较窄的杀细菌作用。

微生物抗菌肽的合成 1 非核糖体合成的抗菌肽是由细菌、真菌和链霉菌等分泌的具有抗菌活性的肽类物质。按照多载体硫模板机制在肽合成酶的作用下合成的。 2 肽合成酶基因(如杆菌肽S生物合成操纵子grsB)大小为13kb，含有4--6个模板，每个模板都可识别、激活一个氨基酸残基，并且在必要的时候对其进行修饰，添加到正在合成的肽链上。 3 在这种机制控制下可以合成许多含有羟基、L-氨基酸和D-氨基酸的肽类物质，再通过N-基化、酰化、糖基化或杂环形成作用等进一步的化学修饰，成为具有生物活性的抗菌肽。

动物来源的抗菌肽 动物在长期自然进化过程中，其体内已建立了一套维持其体内菌群稳态的机制。抗菌肽是这一机制中的主要因子之一。 防御素是哺乳动物中研究最多的抗菌肽，其分为α－defensin和β-defensin两大类。其中，β－defensin是一组具有独特氨基酸序列的抗菌肽，含38－42个氨基酸，有3个分子内二硫键，其中6个cys残基在肽链上所处位置与defensin家族不同，且N端有一个不同于defensin的5一羟脯氨基。 如昆虫抗菌肽、牛抗菌肽、猪抗菌肽和羊抗菌肽等。。

动物来源的抗菌肽

动物来源的抗菌肽合成 动物抗菌肽是由核糖体合成的天然抗菌肽，机体在抵御病原微生物的防御反应过程中所产生的一类抗微生物与一些恶性细胞的短肽(antimicrobial and malignant-cell-toxic peptides)。 这些肽类是由基因编码、宿主细胞产生的一类抗菌分子，是有机体在进化过程中为适应环境、求得生存而最早产生的免疫活性分子，其分子量较小，一般在4000Dr左右，肽链在几十个氨基酸残基左右，被认为是天然免疫的重要介质，对G(右上为＋)菌、G(右上为－)菌、霉菌、螺旋体、病毒(如流感病毒、疱疹病毒、艾滋病病毒)等均具有很强的杀伤活性。

昆虫抗菌肽 Entomed公司在昆虫抗菌肽的研究方面取得了较大进展。 从热带小蝴蝶身上提取了一种抵抗目前治疗曲霉感染非常有效的分子，并在老鼠身上进行了试验，毒性很低，准备在人身上进行临床试验。 世界上已知有200万种昆虫，平均每一种都能产生200种肽。至今为止， Entomed公司研究了200种昆虫，如瓢虫、金龟子等，从未发现有相同的肽分子。

牛抗菌肽 Schonwetter等研究表明，在牛气管上皮发现的抗菌肽TAP和舌上皮发现的抗菌肽LAP均属β-defensin家族，分别由42和38个氨基酸组成，都有抗G－菌和G＋菌及真菌活性作用。 牛中性粒细胞中分离出的是一个环状的十二肽Bactencin；牛奶中也分离出3种抗菌肽，试验表明其具有抑制肠毒性大肠杆菌及单核细胞增多性李氏杆菌的生长。

猪抗菌肽 Lee等（1989）首先从猪小肠分离出抗菌肽ce-cropin p1，其含31个氨基酸残基，分子量 3339 Da，不含cys。 PR－39是另一个从猪小肠分离到的抗菌肽，分子量为4717 Da，含7种氨基酸，富含Pro和Arg，对G－菌如大肠杆菌、沙门氏菌和G＋菌如巨大芽孢杆菌、化脓链状球菌都很敏感。 Protegrins（PGs）是从猪白细胞中分离到的抗菌肽，富含Cys，具有抗G＋菌、G一菌及HIV病毒活性。

羊抗菌肽 在绵羊中至少已发现10种抗菌肽基因，从绵羊、山羊白细胞分离的抗菌肽OaBac5和CHBac5与牛Bac5同源，富含Pro，具有广谱抗菌特点，且在低盐浓度下仍有抗菌活性。 Shamova等研究发现，富含Pro的Bacs肽类在反刍动物中高度保守，这可能有利于其先天的防御体系。

人 defensin 人 defensin家族抗菌肽是存在于粘膜上皮中，含有3对二硫键，氨基酸残基数为29－40，其作用是抵御外来侵染的第一条防线。

人 β-defensin-1 阳离子Cys-rich 抗菌肽 最初从血滤液（ hemofiltrate ）中分离获得 与人β-defensin-2相似专门作用于Gram 阴性菌，例如：大肠杆菌和绿脓杆菌 在泌尿生殖道、肺和气管的上皮中发现，与其它的 defensins 一起可成为探索自我防御机理的有效工具

抗菌肽具有广谱杀菌作用，其抗菌机理与其结构有着千丝万缕的联系 三 抗菌肽的作用机理 抗菌肽具有广谱杀菌作用，其抗菌机理与其结构有着千丝万缕的联系

抗生素的作用机制

抗菌作用机理I 抗菌肽在结构上大多具有两亲性α螺旋，也有一部分具有两亲性β片层或同时具有以上两亲性α螺旋和两亲性β片层结构。 通过其两亲性α螺旋上的正电荷与细菌细胞质膜磷脂分子上负电荷之间的静电吸引而结合在质膜上，紧接着抗菌肽分子的借助于分子中的连接结构的柔性，随即插入到质膜中，之后α螺旋也插入到质膜中，打乱了质膜上蛋白质和脂质原有的排列秩序。 由于抗菌肽的α螺旋是亲水、疏水两性的，最终通过膜内分子间的相互位移，使抗菌肽分子相互聚集在一起形成离子性通道。使细菌失去了膜势，不能保持正常的渗透压而死亡。

抗菌作用机理II 防御素分子可能有3种方式与脂质双层相互作用并渗透质膜，提出了渗透脂质双层的契形模型和孔道模型假说。 契形模型中，二聚体的疏水表面埋入脂质双层中，破坏脂质双层间的相互作用从而渗透质膜；孔道模型中，两个二聚体在质膜中装配成极性的头对头，两个非极性的尾对磷脂膜的模式，上述二聚体旋转90度，然后几个二聚体首尾相连从而横跨质膜，形成孔道。 抗菌肽的抗菌机理与抗生素的抗菌机理是不同的，而且病原菌不易对其产生耐药性，因而抗菌肽将会是新抗菌药的来源。

Proposed mechanism of action of antibacterial peptides

抗菌作用机理 抗菌肽的主要作用位点是细菌的细胞膜，并在细胞膜双分子层上形成孔道，使胞内生命物质外泄而致细菌死亡。 由于动物细胞膜成份和病原体的膜成份不同，抗菌肽对两者有很大的差别毒性，据报道对病原体的毒性是动物细胞的100倍以上（以红细胞为对照）。

应用前景 转基因应用：仔猪腹泻、奶牛乳房炎及各种病毒性疾病（如猪瘟、鸡新城疫等）一直是棘手的疾病。借鉴昆虫抗菌肽转基因工程，把特异的抗菌肽基因转人畜禽特定细胞让其表达，从而产生抗病新品种。 添加剂生产：基因工程方法生产环保型抗菌肽添加剂，，使畜产品无抗生素残留的目的。 抗菌药物：原核核真核系统表达生产药用价值的抗菌肽。

抗菌肽的临床应用 目前，仅有5个有关抗菌肽临床应用试验。 (1)IB-367，一种整合素样分子，治疗癌症病人因放疗和化疗引起的多微生物参与的口腔黏膜炎症的Ⅲ期临床试验； (2)IB-367气雾剂治疗囊性纤维素样肺病患者的肺部绿脓杆菌感染的Ⅱ期临床试验； (3)Indolicidin防止中心静脉插管部位感染的Ⅲ期临床试验； (4)MBI-226防止中心静脉插管部位感染的Ⅲ期临床试验； (5)Indolicidin样肽治疗急性痤疮的Ⅱ期临床试验。

四 抗菌肽基因克隆、研究策略 真核基因表达调控是一个复杂的过程，转录因子可以形成复合物与调控元件相互作用，以及它们构象的变化、基因的修饰等都在调控过程中起作用。阐明抗菌肽的调控机制对于深入认识机体抵抗病原微生物的侵袭机制，进而人为地调控抗菌肽的表达，增强机体抗感染能力都有重要意义。

重组抗菌肽的克隆策略 Cecropin B和β-Defensin家族抗菌肽 构效分析设计突变分子 DNA片段合成 多肽合成 形成筛选库 在大肠杆菌中 克隆和表达 抗菌分析 化学修饰 有潜力的化合物

The amino acid sequence of rhesus theta defensin-1 (RTD-1) 罗猴防御素－1

Schematic of the covalent structure of RTD-1

A theoretical model of RTD-1

RTD-1 precursors and genes.

克隆与表达 据英国《新科学家》杂志报道，美国佛罗里达大学的丹尼斯·格雷等人将蚕的一种基因植入葡萄后发现，该基因能够控制产生一种名叫抗菌肽的蛋白质，附着在皮尔斯病致病细菌的细胞膜上，进而进入病菌内部，杀死病菌。 新的基因主要在葡萄藤的木质部发挥作用，在果实等部分产生的抗菌肽较少。他们正在尝试使基因只在木质部起作用，避免抗菌肽通过葡萄果实进入人类食物链，防止产生新的食品安全疑虑。

抗菌肽的新基因 我国科学家在生殖系统基因研究中取得重大突破：在国际上首次从大鼠附睾头部上皮细胞中成功地克隆到一个特异表达地新基因，并观察到这个基因所编码的多肽具有抗菌功能，并可能与生育有关。 这一天然抗菌肽新基因有望发展成为特异的治疗男性附睾炎的新型药物，以减少男性不孕症的发生，也可能成为一种用于男性的新型避孕药物。

抗菌肽基因克隆 中国农业科学院生物技术研究所已成功地人工合成和改造了来自天蚕蛾的抗菌肽基因，并导入我国马铃薯主栽品种米拉，获得抗病性提高Ｉ∽Ⅲ级的抗青枯病的转基因株系，现已经农业部批准在四川省进行环境释放。目前抗菌肽基因已经供给国内10多家研究单位，进行抗水稻白叶枯病、马铃薯软腐病、花生和番茄的青枯病、大白菜软腐病、柑桔细菌性溃疡病、桑树和桉树青枯病、樱桃根肿病等抗细菌病基因工程研究。

研究用抗菌肽的价格 抗菌肽 数量 价格（美元） a-Defensin-1 (Human) Human Newtrophil Peptide (HNP-1) 0.1mg 202 b-Defensin-2 (Human) hBD-1 220 b-Defensin-2 (Human) hBD-2 230 b-Defensin-2 (Human) Antiserum (Rabbit) Antiserum: lyophilized from 0.001 M phosphate buffer (pH 7.0) 50ml 320 Magainin 1 0.5mg 255

五 基因工程药物的研究开发

历史后顾     1965年，我国在世界上首次人工合成了牛胰岛素，1981年又人工合成了具有生物活性的结晶蛋白质----酵母丙氨酸转移核糖核酸，1998年又研制成功基因重组人胰岛素，标志着我国在人工合成生物大分子方面的研究居世界领先地位。 人工合成牛胰岛素结构图

历史后顾 1982年美国Lilly公司首先将重组胰岛素投放市场，标志着世界第一个基因工程药物的诞生。迄今为止，已有50多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。

制备方法 生产基因工程药物的基本方法是：将目的基因用DNA重组的方法连接在载体上，然后将载体导入靶细胞（微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细），使目的基因在靶细胞中得到表达，最后将表达的目的蛋白质提纯及做成制剂，从而成为蛋白类药或疫苗。

发展状况 据最新统计，美国的生物技术公司已有约2000家（包括1300多家生物药物相关公司），其中已有约300多家已经上市，吸引了大量的政府及民间资本。1997年美国生物技术产业研发总投入76亿美元，销售总收入174亿美元，其中基因工程药物超过60亿美元。 欧洲共有约1000家生物技术公司，其中以英、德、法为主，1997年研发总投入18亿美元，总收入29.8亿美元。 日本具有相当强的生物技术研究、产业化实力及市场。据日本通产省估计，到达2001年，日本基因工程药品的总市场将达到3兆日元。

15个代表性的产品 Epogen（EPO，红细胞生成素），Humulin（胰岛素，Intron-A（α-IFN，α-干优素），Engreix-B（乙肝疫苗），Cerezyme（葡萄脑苷脂酶），Activase（t-PA，组织纤维蛋白溶酶原激活剂），Humatrope（somatropin，hGH，生长激素），Reoprro（Gpllb/IIIa抗体），Avonex（IFNβ-la，β-la干扰素），protropin/Nutropin（somatrem/somatropin），Pulmozyme（α-链球菌DNA酶Dornase，Proleukin（IL-2，白介素-2和Leukine（GM-CSF，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，

肿瘤坏死因子TNF 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF) 1975年Carswell等发现接种BCG的小鼠注射LPS后，血清中含有一种能杀伤某些肿瘤细胞或使体内肿瘤组织发生出血坏死的因子。 1985年Shalaby把巨噬细胞产生的TNF命名为TNF-α，把T淋巴细胞产生的淋巴毒素(lymphotoxin,LT)命名为TNF-β；TNF-α又称恶质素。 TNF在体内、体外均能杀死某些肿瘤细胞或抑制增殖作用。肿瘤细胞株对TNF-α敏感性有很大的差异， TNF-α对极少数肿瘤细胞甚至有刺激作用。

IL-11酵母表达与大肠杆菌表达系统比较 酵母分泌表达系统 大肠杆菌表达系统 胞外分泌表达，无需破菌 胞内表达，需破菌 表达方式 不存在宿主蛋白、DNA 和内毒素等 可能存在宿主蛋白、DNA 和内毒素等 转化方法 直接柱层析，中间步骤少，污染机会小 需要中间物切割处理，处理步骤较多，污染机会大 临床副作用 发热、 水肿，心悸等少见 发热、水肿，心悸等发生率较高

以小分子有效化合物为筛选目标 以人体内源性产物为筛选目标 以现有上市的基因工程药物进行分子改造 六 新的基因工程药物的研究策略 以小分子有效化合物为筛选目标 以人体内源性产物为筛选目标 以现有上市的基因工程药物进行分子改造

特点 开发活性蛋白生物创新药的成功率按开发的5个阶段大致是：临床前的成功率为15%，一期临床为27%，二期临床为40%，三期临床为80%，注册登记为90%，总体成功率大大高于化学药。 适应症不断延伸也是蛋白类药物的一大特点。例如，rhG-CSF，91年上市时批的适应症是化疗并发中性粒细胞减少，到95年11月13日止，又增加了骨髓移植，严重慢性中性粒细胞减少及外周及外周血干细胞移植等适应症。因此，基因工程生物药物发展包括新品种和新适应两个方面。

状况 美国药物研究与制造协会（PhRMA）统计，到1998年，有近400个生物技术药物处于不同的研究开发阶段（指已完成临床前工作的），其中肿瘤及相关疾病151种、传染病36种、AIDS/HIV感染及相关疾病29种、心脏疾病28种、神经系统疾病26种、呼吸系统疾病20种、自身免疫性疾病19种、皮肤疾病14种、移植14种、糖尿病及相关疾病28种、自身免疫性疾病19种、皮肤疾病14种、移植14种、糖尿病及相关疾病9种、血液疾病8种、生长发育障碍4种、不育症4种、眼部疾病3种，其它疾病22种。

状况 正在开发的生物工程药物按分子类别归类，排在前九位的分别是： 单克隆抗体、疫苗、基因治疗、白介素、干扰素、生长因子、重组可溶性受体，反义药物和人生长激素。 广义地讲，这些药物几乎全是基因工程药物。

与基因工程药物研究相关的领域 组合化学（combinatorial chemistry）、药学基因（pharmacogenomics）、蛋白组学（proteomics）、蛋白治病（gene therapy）、功能抗原学（functional antigenics）、生物信息学（bioinformatics）、高通量筛选（high-throughput screenign）和众所周知的基因组学（genomics，包括后基因组学）等。 HGS公司宣布申请第一个由基因组学而发现的蛋白候选药──骨髓前体细胞抑制因子I（Myelod Porgenitor Inhibitor Factor-I，MPIF-I）上临床（IND），用于使癌症病人能接受更高强度的化疗。

基因工程产品APAF-1  APAF-1(Apoptosis Protease Activating Factor-1)即人类抗菌肽基因激活因子。 APAF-1产品主要用于泌尿生殖道致病菌（如各类性病）的防治，准备以清毒产品的形式首先面市。 该项目现已完成APAF-1的制备，并完成了对各类性病病菌的杀灭试验，正准备进行稳定性试验。

第八讲 新的受体拮抗剂筛选研究策略