现代生物技术试验四 绿色荧光蛋白工程菌株的构建与表达调控 黄绍松 现代生物技术试验四 绿色荧光蛋白工程菌株的构建与表达调控 黄绍松 基因工程(genetic engineering)和遗传工程的英语中是同一个词汇。从字面上看,遗传工程就是按人们的意思去改造生物的遗传特性、或创建具有新遗传物性的生物。遗传是由基因决定的，改建生物的遗传性，就是改建生物的基因，因此狭义的遗传工程就是基因工程。 对多数生物来说，基因本质是DNA，基因工程就是要改建DNA，涉及DNA序列的重新组合和建造，所以基因工程的核心就是人工的DNA重组（DNA recombination）。 重组、建造的DNA分子只有纯化繁殖才有意义。纯的无性繁殖系统称为克隆。纯化繁殖DNA就称为DNA克隆或分子克隆，基因的纯化繁殖就称为基因克隆。所以DNA重组和分子克隆是与基因工程密切不可分的，是基因工程技术的核心和主要组成部分。重组DNA、分子克隆甚至成了基因工程的代名词。 只有当人类对遗传现象本质和规律有深入的认识，才能按人类的意志去改造或创建生物的遗传特性。20世纪50-60年代分子遗传学的迅速发展，确定了主要遗传物质DNA的双螺旋结构、阐明了遗传信息传递的中心法则、破译了遗传密码，为基因工程奠定了理论基础；同时酶学、细菌学、病毒学的发展，为基因工程提供了必要的工具。1972-1973年Boyer、Cohn和Berg等创立了DNA克隆技术，打破了种属的界限，第一次使本来只存在于真核细胞中的蛋白质能够在大肠杆菌中合成，这是基因工程诞生的里程碑。科学界公认基因工程的出现是20世纪最重要的科学成就这一。标志人类主动改造生物界的能力进入新的阶段。分子生物学的成就是DNA重组技术和基因工程出现和发展的基础，而DNA重组技术和基因工程的发展又有力地推动着分子生物学的进步。 基因工程属于生物技术范畴，生物技术（biotechnology）不是一个独立的学科而是一套技术或手段。广义的生物技术指任何利用活的生物体或其一部分生产产品或改良生物品质的技术；狭义的生物技术是专指以DNA重组技术和单克隆技术为标志发展起来的新技术。如无特别说明，通常生物技术一词就专指新的生物技术而言。一般认为这新的生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程几方面的内容。基因工程是生物技术的核心和关键，是主导技术；细胞技术是生物技术的基础；酶工程是生物技术的条件；发酵工程是生物技术获得最终产品的手段，四个方面相互联系的。生物技术是一个综合技术体系，其中基因工程和细胞融合技术最为突出。蛋白质工程（protein engineering）则是在基因工程基础上综合蛋白质化学、蛋白质晶体学、计算机学辅助设计等知识和技术发展起来的研究新领域，开创了按人类意愿设计和研制人类需要的蛋白质的新时期，被称为第二代基因工程。

实验目的 掌握质粒DNA的分离纯化、酶切连接、电泳分析，感受态的制备，质粒的热激转化与电击转化，转化子的筛选与目的基因的诱导表达等一系列分子生物学基础实验方法 通过实验深入理解实验原理和相关理论 充分理解操纵子模型在表达调控中的作用机理 在实验体会掌握实验过程的安排与控制，微量操作和避免污染在分子生物学实验中的重要性。

在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子(DNA重组)； 实验原理 在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子(DNA重组)； 将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一目的DNA分子(基因克隆)； 目的基因在受体细胞、重组载体和外界因素的共同作用下表达，达到大量生产其编码的保持生物活性的蛋白质或实现受体细胞新的生物学特征的目的的过程（基因工程）。 基因工程(genetic engineering)和遗传工程的英语中是同一个词汇。从字面上看,遗传工程就是按人们的意思去改造生物的遗传特性、或创建具有新遗传物性的生物。遗传是由基因决定的，改建生物的遗传性，就是改建生物的基因，因此狭义的遗传工程就是基因工程。 对多数生物来说，基因本质是DNA，基因工程就是要改建DNA，涉及DNA序列的重新组合和建造，所以基因工程的核心就是人工的DNA重组（DNA recombination）。 重组、建造的DNA分子只有纯化繁殖才有意义。纯的无性繁殖系统称为克隆。纯化繁殖DNA就称为DNA克隆或分子克隆，基因的纯化繁殖就称为基因克隆。所以DNA重组和分子克隆是与基因工程密切不可分的，是基因工程技术的核心和主要组成部分。重组DNA、分子克隆甚至成了基因工程的代名词。 只有当人类对遗传现象本质和规律有深入的认识，才能按人类的意志去改造或创建生物的遗传特性。20世纪50-60年代分子遗传学的迅速发展，确定了主要遗传物质DNA的双螺旋结构、阐明了遗传信息传递的中心法则、破译了遗传密码，为基因工程奠定了理论基础；同时酶学、细菌学、病毒学的发展，为基因工程提供了必要的工具。1972-1973年Boyer、Cohn和Berg等创立了DNA克隆技术，打破了种属的界限，第一次使本来只存在于真核细胞中的蛋白质能够在大肠杆菌中合成，这是基因工程诞生的里程碑。科学界公认基因工程的出现是20世纪最重要的科学成就这一。标志人类主动改造生物界的能力进入新的阶段。分子生物学的成就是DNA重组技术和基因工程出现和发展的基础，而DNA重组技术和基因工程的发展又有力地推动着分子生物学的进步。 基因工程属于生物技术范畴，生物技术（biotechnology）不是一个独立的学科而是一套技术或手段。广义的生物技术指任何利用活的生物体或其一部分生产产品或改良生物品质的技术；狭义的生物技术是专指以DNA重组技术和单克隆技术为标志发展起来的新技术。如无特别说明，通常生物技术一词就专指新的生物技术而言。一般认为这新的生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程几方面的内容。基因工程是生物技术的核心和关键，是主导技术；细胞技术是生物技术的基础；酶工程是生物技术的条件；发酵工程是生物技术获得最终产品的手段，四个方面相互联系的。生物技术是一个综合技术体系，其中基因工程和细胞融合技术最为突出。蛋白质工程（protein engineering）则是在基因工程基础上综合蛋白质化学、蛋白质晶体学、计算机学辅助设计等知识和技术发展起来的研究新领域，开创了按人类意愿设计和研制人类需要的蛋白质的新时期，被称为第二代基因工程。

主要内容及实验流程 具有表达元件质粒的菌株 B pEV-32 含gfp基因的菌株A CT-gfp 大肠杆菌DH5-a 挑取单菌落过夜培养 液体接种培养4-6小时 质粒提取电泳检测 质粒提取电泳检测 氯化钙处理制备感受态 质粒纯化酶切,获得gfp基因 质粒纯化酶切获得插入缺口 热激转化，筛选 回收gfp基因片段 回收能插入外源片段的表达载体V 转化子的鉴定与诱导表达 片段的连接gfp+V=pEV-gfp

实验过程控制 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天 1.试剂，耗材清洗灭菌，培养基的制备 4h 2.三株菌的活化培养 过夜:12h 5.质粒的酶切 过夜 6.酶切片段的电泳分离与回收 3h 7.筛选与诱导表达培养基的制备 4h 8.回收片段的连接 过夜 9.热激转化 2h 10.转化子的筛选 12h 11.诱导表达与鉴定 12~16h 第一天 第二天 第三天 第四天 第五天

具体操作参见 1.分子生物学实验指导 刘进元 张淑平 武耀廷 第二版（教材）基础实验部分 2.分子克隆实验指南 J.萨姆布鲁克 D.W拉塞尔 主编 黄培堂译 p1~103 1564~1616 3.关于蛋白结构、质粒图谱查阅网址：www.ncbi.nlm.gov 4.各种试剂性能特征参见 ；www.biosupplynet.com 5.试剂盒及各种酶在使用之前请详细阅读其附带的说明书

实验的理想结果 转化前 转化后

DNA重组基本过程 目的基因 表达载体 构建的表达质粒

1、获取片段及重组

2、转化

3、筛选

4、表达及表达产物的纯化 表达产物分离纯化

DNA重组基本程序包括下列过程 分—获取目的基因和载体 切— 使用工具酶把目的基因和载体切割成可连接的片段 接—目的基因与载体的连接 表—目的基因在受体细胞内的表达

一、目的基因的获取（分） 目的基因 是指所要研究或应用的基因，也是需要克隆或表达的基因。 目的基因来源 1） 制备基因组DNA 2） 制备cDNA 3） 聚合酶链反应 4） 人工合成基因

（一）制备基因组DNA（基因文库） 分离、纯化基因组DNA 条件：温和，在EDTA或SDS等存在下 ↓RE 用蛋白酶K消化细胞、酚抽提 大小不同酶切片段 片段分离：常用蔗糖梯度或电泳分离 ↓ 分别与同样RE消化的载体连接 常用噬菌体载体或质粒载体 ↓ DNA连接酶连接。 导入细胞 进入宿主细胞内培养扩增。 筛选鉴定 用分子杂交、凝胶电泳 等方法鉴定。

（二）制备cDNA （cDNA文库） （1）合成cDNA第一条链 反应体系只有mRNA、逆转录酶、4种dNTP、引物。 引物是与mRNA3ˊ端 polyA互补的寡聚dT（12～18dT片段） （2）合成cDNA第二条链 RNase去掉模板mRNA （3）构建cDNA文库 ①　cDNA两端加接头或衔接头 接头是人工合成的双链寡核苷酸两端平头，含有限制酶切位点。 衔接头是另一种人工合成的双链寡核苷酸一端平头，另一端为粘性末端。 ②　cDNA与载体相连。 ③　导入宿主细胞进行克隆，这些菌体内保存cDNA集合体便是cDNA文库。

（二）制备cDNA （cDNA文库） 导入宿主细胞克隆,构建cDNA文库 分离目的基因 的mRNA 逆转录生成cDNA单链 水解回折处单链 得到平端双链cDNA 导入宿主细胞克隆,构建cDNA文库

引用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。 （三）聚合酶链反应( PCR) 在模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶等条件下，体外经94℃变性、54℃退火及72℃延伸3个步骤的反复多次循环（2530次），扩增目的基因。 （四）人工合成基因 引用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。 一般先合成短片断DNA，然后再拼接成长片段。

二、 目的基因与载体的连接（接） （主要有以下4种连接方式） 1) 粘性末端连接 2） 平头末端连接 3） 人工接头法 4） 同源多聚尾连接法

相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子。 （一） 粘性末端连接 将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生 相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子。 （二）平头末端连接 某些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成 平端，此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起 来。

（三） 人工接头法 合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割,产生粘性末端→连接，构建重组DNA。

（四）同源多聚尾连接法

三、重组DNA导入宿主细胞（转） 无性繁殖 克隆 宿主细胞 体外重组后的DNA导入受体细胞，形成转化子。然后随受体细胞生长、增殖，使重组DNA发生复制、扩增，这一过程称为无性繁殖。 克隆 从上述无性繁殖细胞中进一步筛选出含目的DNA的重组体分子即为无性繁殖系或克隆。 宿主细胞 进行无性繁殖时所采用的受体细胞.

用特殊方法处理后，受体细胞才具备接受外源DNA的能力， 这种细胞称感受态细胞。 转化 以质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程； 转染 以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程； 转导 以噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。 感受态细胞 用特殊方法处理后，受体细胞才具备接受外源DNA的能力， 这种细胞称感受态细胞。 感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。

（筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法） 四、重组DNA的筛选与鉴定（筛） （筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法） 1） 平板筛选 2） 限制酶切图谱筛选 3） PCR筛选重组体 4） 原位杂交技术 插入失活 蓝－白筛选

是指利用载体的遗传性标记直接筛选的方法。 （一） 平板筛选 是指利用载体的遗传性标记直接筛选的方法。 如，具有抗药性标记的载体，转化宿主细胞后，能 在含抗生素（Amp或Tet）的培养平板上生长；未转 化的则不能生长。 插入失活 当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使 该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的 培养平板上。

抗生素平板筛选（插入失活）

它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，筛选含有编码β-半乳糖苷酶的基因。 （2）蓝-白筛选 它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，筛选含有编码β-半乳糖苷酶的基因。 载体：编码β-半乳糖 宿主： 编码β-半乳糖 苷酶N端序列 苷酶C端序列 （IPTG 存在下） α-互补 细菌表达： β-半乳糖苷酶活性蛋白↑ 5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落 当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→不能与宿主β-半乳糖苷酶的C端进行α-互补→产生白色菌落。

蓝－白筛选示意图

2. 限制性内切酶图谱鉴

3. PCR筛选重组体 抽提少量重组DNA→PCR扩增→电泳鉴定→序列分析。 4. 原位杂交技术

五、重组体在宿主细胞中的表达和调控 基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。 克隆基因表达有三个条件 ⑴ 基因的编码区不能被插入序列所中断; ⑵ 基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主 细胞的RNA聚合酶有效地识别; ⑶ mRNA必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外 源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。

基因工程生产胰岛素的原理（示意图）

基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的 三、制备基因工程疫苗 基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的 一些特殊的病原体疫苗。如， （1） 乙型肝炎病毒疫苗（HBV）、丙型肝炎病毒疫 苗（HCV）等； （2） 有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人 T细胞免疫缺陷病毒（HITV-1）等； （3） 常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等 （4） 制备一些多价疫苗等。

四、改良物种特性

↓ 动物药厂 ↓ ↓ 通过转基因动物生产感兴趣的基因 把YFG放在β—乳球蛋白的启动子下 注入羊卵细胞→植入借腹怀孕的母羊体内 　　　↓ 把YFG放在β—乳球蛋白的启动子下 　　　　↓ 注入羊卵细胞→植入借腹怀孕的母羊体内 　　↓ YFG在乳腺中表达 乳汁中提纯YFG蛋白。

五、动物克隆 1. 分离体细胞 （先处于“饥饿”的“静止状态”） →使“关闭”的基因全部“打开”。 2. 植入去核的卵细胞中→胚胎细胞 1. 分离体细胞 （先处于“饥饿”的“静止状态”） →使“关闭”的基因全部“打开”。 2. 植入去核的卵细胞中→胚胎细胞 3. 将胚胎细胞植入寄养母体内。