第九章 发育毒性与致畸作用

第一节 概述

(developmental toxicology) 一、发育毒理学 (developmental toxicology) 研究发育生物体在受精卵、妊娠期、出生后、直到性成熟的发育过程中，由于出生前接触导致异常发育的理化因素或出生后的发病机制和结果

二、从畸胎学到发育毒理学 现代实验畸胎学始于19世纪初 作用时间对决定畸形类型更为关键 反应停事件促进研究以及管理 1966年FDA提出三段生殖毒性试验指南 80年代EPA提出可疑发育毒物危险度评价指南，首次明确提出对发育毒性的评价

第二节 发育毒性与致畸性

一、基本概念和发育毒性的终点 1．畸形 (malformation) 出生前因素引起发育生物体的严重的解剖学上形态结构的缺陷 对发育、生长、形态、生理功能、生育力和（或）寿命可产生有害影响 可以存活也可能死亡

致畸性（teratogenicity） 致畸作用（teratogenic effect） 在妊娠期（出生前）接触外源性理化因素引起后代结构畸形的特性或作用 致畸物（teratogen） 在妊娠期接触能引起子代畸形的理化因素 选择性致畸物 能在无明显母体毒性剂量下诱发畸形

2．变异（variation） 由遗传和遗传外因素控制的外观变化，或由于分化改变而引起的中途歧异（deviation）

3. 胚胎-胎儿毒性 胚胎毒性（embryotoxicity） 外源性理化因素造成的着床前后直到器官形成期结束的所有毒性表现 胎儿毒性（fetoxicity） 器官形成期结束后的因素引发的任何毒性表现（死亡、低体重、骨化迟缓、功能缺陷以及结构异常）

4. 发育毒性（developmental toxicity） 出生前经父体和（或）母体接触外源性理化因素引起的在子代到达成体之前出现的有害作用 结构畸形、生长迟缓、功能障碍及死亡 发育毒物（developmental toxicant） 能造成发育毒性的物质

5. 出生缺陷（birth defect） 婴儿出生前即已形成的发育障碍 形态结构异常（畸形）和功能缺陷（智力低下、代谢和行为异常）

二、发育毒性作用的特点 （一）着床前期 分化前期，从受精时算起，到完成着床之前的一段时间 着床前丢失（preimplantation loss）：未分化细胞受化学毒物损伤而致胚泡死亡

（二）器官形成期 孕体着床后直到硬腭闭合的一段时间 致畸敏感期或致畸作用危险期 (critical period) 器官结构畸形 胚胎死亡 吸收胎（resorption） 流产

各个器官发育最旺盛时感受性最强，不同器官的敏感期（target window）不同，且有交叉重叠 表现 在器官形成期中不同时间给予致畸物会诱发不同器官畸形 同一天染毒可引起多个器官受损

反应停的敏感期：末次月经后第34到50天　　 第35--37天：耳朵畸形和听力缺失 第39--41天：胎儿上肢缺失 第43--44天：双手呈海豹样3指畸形 第46--48天：胎儿拇指畸形　　

(三)胎儿期 器官形成结束后（人类从第56-58天起），直到分娩的一段时间 以组织分化，生长和生理学的成熟为基本特色。接触发育毒物很可能对生长和功能成熟产生效应 全身生长迟缓 特异的功能障碍 经胎盘致癌 死胎

三、母体毒性与发育毒性 （一）母体因素对发育毒性的影响 母体毒性(maternal toxicity) 化学毒物对孕母产生的损伤作用 增重减慢、功能异常、临床症状、死亡 常用增重减慢和死亡率来表示

1．遗传学 孕母的遗传结构是孕体发育结果的一个决定因素 如唇腭裂[CI(P)]的发病率依赖于母体的而非胚胎的基因型，白人中的发病率比黑人中更高。在两个相关的小鼠品系AJ系和CL/Fr系中，自发CL(P)率分别为8%-10%和18%-26%

2．疾病 母体未控制的糖尿病，某些母体的感染，经过间接的疾病相关的母体变化或直接经胎盘的感染对孕体有不利的影响。如巨细胞病毒感染与胎儿死亡，小头畸形，心智发育延滞、盲目和耳聋有关联 过高热是实验动物的强致畸因子，在人类妊娠最初三个月内母体发热与中枢神经系统畸形有关

3．营养 蛋白质、热量、维生素，微量元素及酶辅因子的缺乏已知对妊娠有不利的影响 有生育神经管缺陷（NTDs）婴儿危险的妊娠妇女，补充4 mg叶酸可减少NTD复发超过70%

4．应激 不同形式的母体毒性可能通过诱导生理学的应激反应产生发育毒性 妊娠大鼠和小鼠对贯穿妊娠期的噪声应激可产生发育毒性

5．对胎盘的毒性 胎盘能代谢和（或）储存外源化学物 胎盘也可能是毒作用的靶 胎盘毒性可能危及其功能和产物，或促进对孕体的有害效应

（二）母体毒性与胚胎毒性的关系 1．具有胚胎毒性，但无母体毒性 致畸作用有特定的机制，与母体毒性无关，如反应停 最容易被忽视也最危险

2．同时出现胚胎毒性和母体毒性 只在母体毒性时，观察到发育毒性 效应可能是间接的 往往不具有特定的致畸机制 可能是母体生理学的紊乱的继发效应

3．具有母体毒性，但不具有致畸作用 这类物质在妊娠期很容易引起警觉，避而远之 4．在一定剂量下，既无母体毒性，也不表现胚胎毒性

四、剂量-反应模式和阈值 发育毒性效应主要是胚胎致死，畸形和生长迟缓。其剂量-反应（效应）关系十分复杂，并且因化学物的类型，暴露的时间和剂量而改变

（一）发育毒性的剂量-反应模式 1．除了在较高剂量几乎全窝胚胎死亡外，正常胎、生长迟缓和结构畸形同时存在

2．在远低于胚胎致死剂量下即可出现致畸，甚至全窝致畸

3．有生长迟缓和胚胎致死但没有畸形发生

（二）发育毒性的阈值概念 需要极大的样本数，难以用实验找出一个发生率很低的剂量-反应关系 多数发育毒性机制还不了解，或支持或不支持阈值的存在 考虑个体的阈值和群体的阈值之间的区别

第三节 致畸(发育毒性)作用机制

1．干扰基因表达 在培养的小鼠胚胎中用反义寡核苷酸探针抑制原癌基因Wnt-1或Wnt-3a，可产生中脑和后脑，或中脑、后脑和脊髓的畸形 剔除Wnt-1基因的突变小鼠也可产生中脑和后脑的畸形 向小鼠胚胎中加入鸡的-肌动蛋白启动子时，Hox-1.1基因表达，并产生多种颅脸部和颈椎的畸形

2．基因突变与染色体畸变 诱变原有潜在致畸性，如电离辐射、烷化剂、亚硝酸盐、多数致癌物都可能致畸 妊娠第13天的大鼠胚胎羊膜内注入CP及其两个代谢活化的致畸性产物PM或AC后，CP和AC引起了脑积水、露眼、腭裂、小领畸形、脐疝、尾部和肢部缺陷；而PM仅仅引起脑积水，尾部和肢部缺陷

常染色体数目的过多或缺少常常使胚胎死亡，难以发现或未作检查。而生殖丢失占很大比例。大量的研究已证实，自发流产的胚胎中至少50%存在染色体畸变。电离辐射，病毒以及能引起染色体畸变的某些化学毒物都有致畸作用

3．损伤细胞和分子水平的翻译 细胞增殖率在个体发生过程中空间和时间都在变化，在胚胎中细胞增殖、分化和凋亡之间有精致的平衡。用CP处理妊娠第10天大鼠，引起胚胎的S-期细胞周期阻断，在细胞迅速增殖区域观察到细胞死亡

细胞周期长度的不同可能部分地影响敏感性。如：胚胎的神经上皮对CP诱导的细胞死亡相当敏感，而心脏有抵抗力。第10天大鼠胚胎神经上皮的细胞周期时间大约为9.5h，而在心脏中的细胞周期大约是13.4h，这是由于心脏细胞比神经上皮有更长的C0/G1期

对DNA的损伤可在G1-S转换时、S期和G2-M转换时抑制细胞周期的进展。CP诱导DNA损伤可导致细胞周期混乱和特定的细胞群体中的细胞死亡。如果DNA损伤被修复，细胞周期能恢复正常，但如果损伤太广泛，或细胞周期抑制太久，可能引发凋亡。在全胚胎培养中使用活化的CP也观察到相似的胚胎细胞周期阻断和细胞死亡

4．细胞凋亡 程序性细胞死亡，指胚胎中在遗传基因的控制之下的特定类型的细胞死亡。凋亡对来自原基的结构的造型是必需的 部分致畸物，如细胞生长依赖激素、乙醇、抗癌药物都能促进细胞凋亡

Mitochondrial apoptotic pathway Background Mitochondrial apoptotic pathway P. E. MIRKES. 2001 Warkany Lecture: To Die or Not to Die, the Role of Apoptosis in Normal and Abnormal Mammalian Development. Teratology, 65:228-239 (2002)

Receptor-mediated apoptotic pathway Background Receptor-mediated apoptotic pathway P. E. MIRKES. 2001 Warkany Lecture: To Die or Not to Die, the Role of Apoptosis in Normal and Abnormal Mammalian Development. Teratology, 65:228-239 (2002)

5．干扰细胞-细胞交互作用 反应停的代谢活化产物引起胚胎细胞的粘连受体(adhesive receptors)下调，阻碍发育过程中细胞与细胞和细胞与基质之间的相互作用，干扰了细胞之间的通讯从而导致肢芽结构异常

6．通过胎盘毒性引起发育毒性 已知对卵黄囊或绒(毛)膜尿囊胎盘有毒性的毒物有46个，包括镉(Cd)、砷或汞、香烟、乙醇、可卡因、内毒素和水杨酸钠等。如Cd在妊娠中晚期通过引起胎盘毒性(坏死，减少血流)和抑制对营养物质的传送导致发育毒性

实验发现，在妊娠晚期大鼠体内注入Cd造成胎儿死亡，但几乎没有Cd进入胎儿体内，而是在10h内伴随子宫胎盘血流减少发生胎儿死亡；如胎儿直接注射Cd，尽管胎儿的Cd负荷比母体给药后高几乎10倍，胎儿死亡仅只有轻微增加

7．干扰母体稳态 二氟苯水杨酸，引起兔的中轴骨骼缺陷。其发育毒性剂量引起严重的母体贫血并损耗红细胞ATP水平。妊娠第5天给单剂量的二氟苯水杨酸引起持续到第15天的母体贫血，而这正是缺氧引起类似的中轴骨骼缺陷的关键日子，胚胎中血药浓度低于母体的血药峰水平的5%。因此，二氟苯水杨酸对兔的致畸性或许是由于母体的贫血造成缺氧的结果

8．内分泌干扰作用 内分泌干扰物为干扰激素的制造、释放、传送、代谢、结合、作用或排除的外源性因子。包括杀虫剂、除草剂、杀菌剂、塑化剂、表面活化剂、有机金属、卤代杂环烃、植物雌激素等

内分泌干扰物引起发育毒性的作用模式 作为类固醇受体的配体起作用 改变类固醇激素代谢酶 扰乱下丘脑-垂体激素释放 目前还不清楚的模式作用

第四节 发育毒性和致畸作用试验与评价

一、动物发育毒性试验 最佳联合方案是对成年动物进行染毒并包括子代从受精卵到性成熟所有生长发育阶段 观察期应贯穿一个完整的生命周期，以检测近、远期效应 最常选用的方案为三阶段试验

I 阶段试验 雌雄性交配前-受孕-雌性受精-雌性着床期间染毒 对成年雌雄性的生殖功能、配子的发生及成熟、交配行为、受精、着床前的发育和着床的影响

Ⅱ阶段试验 从着床到硬腭闭合期间染毒 对成年雌性生殖功能、胚胎发育、器官形成期的发育毒性

Ⅲ阶段试验 从着床到幼仔断乳期间对孕（乳）母染毒 从着床到子代性成熟的母体生殖毒性(妊娠、分娩和哺乳)和子代的发育毒性（胚胎、胎儿生长发育，新生幼仔宫外生活的适应性，断乳前后的生长发育，独立生活能力和性功能成熟）

二、流行病学研究和人类的证据 （一）人类证据的获得 通过流行病学方法来研究环境发育毒物对人类发育的影响，包括其性质、程度以及原因 分析流行病学，有四种化学物：酒精、多氯联苯、卡马西平和可卡因 对出生缺陷登记的分析，丙戊酸

国际生命科学研究所（International Life Sciences Institute，ILSI）1989年根据动物试验中发育毒性效应的类型、严重性和发生率将化学物分为四类，并规定各类型的不同的安全系数范围，用以评定待测物发育毒性的危险度

1．药物 根据药物对人类的孕体造成危险的证据，FDA(1979)对于药物在妊娠期的使用采用字母A、B、C、D和X来进行等级评定，分类管理。ICH人类用药危险度分类研究设计中也有类似规定。要求医生按规定开处方，使妊娠妇女按规定使用这些药品

A类：在妊娠人群中控制良好的研究未能证实有危险 X类：在妊娠期用药是不当的。对胎儿的危险比患者任何可能的受益更重要 C类：不能排除危险。缺乏人的研究，而动物研究缺乏或是阳性，但药物对患者的好处可能证明潜在的危险是值得的

A、B、C类：仅在明显需要，或证明可能受益与对胎儿可能的危险比较是可取时，在怀孕期间可以使用 D类：在怀孕期间使用，应通知病人对胎儿可能的危害 X：怀孕或可能怀孕的妇女中禁止使用

2．环境化学物 对于环境化学物，发育毒性的危险性评价程序的目的通常是要得出一个NOAEL，考虑安全的多变性或不确定因素，最终得出对人假定是相对安全的暴露水平

1996年，美国食物质量防护行动(FQPA)考虑到来自不同来源的同一毒物通过共同的作用模式的联合接触，以及内分泌干扰作用的累积效应，在利用动物实验得到的NOAEL为孩子计算允许摄入量时，除了考虑其他的不肯定因素外，额外增加了10倍的安全系数

3．确认人类致畸物的标准 某种特异的缺陷或几种缺陷综合征的发病率突然增加 缺陷的增加与某种已知的环境改变，如某种新药的广泛使用巧合 已知在妊娠的特殊阶段接触环境的改变，产生有特征性的缺陷综合征 缺少妊娠时引起特征性缺陷婴儿产生的其他普通因子

三、发育毒性的替代试验 (一)大鼠全胚胎培养 (whole embryo culture, WEC) 从孕期第9，10天大鼠子宫取出胚胎，剥去Reichert膜，放入培养液中加入受试物，在含O2、CO2、N2环境中，旋转培养。观察胚胎发育情况，记录胚胎存活，检测胚芽、卵黄囊直径、体节和体长

以胚胎的心跳和血液循环是否存在作为胚胎存活的指标；以卵黄囊直径、颅臀长和头长、体节数和胚胎重作为胚胎生长发育的指标；根据Brown评分对器官形态分化作出评价。筛试化学物的发育毒性、探讨其剂量反应关系和作用机制

(二) 胚胎细胞微团培养 (micromass culture) 从第11天的大鼠胚胎取得代表CNS的原代中脑细胞微团、肢芽区或其他区的细胞微团，在培养瓶中分别加入不同浓度的受试物共同培养5天；用中性红染色判断细胞存活；用Alcian蓝染色判断肢芽软骨细胞分化数量；苏木素染色判断CNS细胞分化数量。对结果进行处理，求出影响终点的IC50。比较受试物组与对照组数据，评价化学毒物的细胞毒性和发育毒性

（三）小鼠胚胎干细胞试验 (the mouse embryonic stem cell test，EST) 将小鼠胚泡内细胞团衍生的胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)在特定条件下，可定向分化为机体多种细胞，因此可作为生物测试系统，用于哺乳动物细胞分化、组织形成过程的发育毒性研究

（四）体内预筛式样（C.K.试验） 原理：大多数出生前受到的损害将在出生后表现为存活力(存活率)下降和(或)生长迟缓 观察出生3天内的新生仔外观畸形、胚胎致死、生长迟缓等发育毒性表现，对新生子代进行外部畸形、生长和生存能力的评估

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